Xenium | 数据输出与结果总览

前言

空间转录组学技术路线大致可分为两类：基于成像的技术和基于测序的技术。基于成像的技术可以直接观察组织切片中的基因表达情况，通常能够实现单细胞或亚细胞级别的分辨率。这类技术的通量可能较低（例如荧光原位杂交技术），也可能较高（例如10x Genomics公司的Xenium技术、Vizgen公司的MERFISH技术以及Bruker公司的COSmx技术），但其应用效果会受到目标基因探针多重标记能力的限制。相比之下，基于测序的技术可以从组织切片中提取RNA并进行测序，从而实现更高的通量及更全面的转录组分析。不过，这类技术在细胞分割方面的准确性可能存在问题，且某些方法无法实现单细胞级别的分辨率。选择哪种技术取决于具体的研究需求，包括所需的分辨率、通量、需要分析的基因数量以及组织类型。使用10x Genomics公司的Xenium In Situ技术，能够在较大的组织切片区域内实现亚细胞级别的空间转录组分析。该技术既适用于组织微阵列的研究，也适用于临床样本中经福尔马林固定和石蜡包埋处理后的组织样本的分析。

Xenium基因panel

通过10x Xenium检测细胞内的RNA表达情况，其原理是识别那些针对特定转录本的基因探针所产生的荧光信号。目前，10x提供了三种主要类型的基因检测试剂盒：

1. 预先设计好的基因检测试panel：预设计好的基因检测试剂盒主要包括Xenium v1和Xenium Prime 5K两种类型, Xenium v1试剂盒包含247至380个目标基因，能够检测人类或小鼠多种组织中的主要细胞类型；而Xenium Prime 5K试剂盒则更为全面，能够检测人类或小鼠转录组中的5,000个基因。用户可以在10xgenomics.com/products/xenium-panels网站上查看这些试剂盒的详细信息。这些试剂盒的基因名称、转录本ID、目标细胞类型、以FASTA格式存储的探针序列以及以BED格式存储的基因组坐标等相关信息均可免费下载。由于这些试剂盒无需进行定制生产，因此交货时间也非常短。
2. 用户自定义的基因检测试panel: 用户可以完全根据自己的需求对这些panel进行定制；每个panel最多可包含480个目标基因。panel的设计是通过10x的Xenium Panel Designer网页应用程序来完成的（无需进行任何安装操作）。该工具能够根据参考的单细胞表达数据，帮助用户合理设计探针在目标基因上的分布方案，并能够对检测panel的性能进行计算机模拟预测。完成panel设计后，10x公司会根据用户的需求定制相应的基因检测panel。
3. 用于补充预先设计好的基因检测panel: 这些小型定制基因检测panel专为与预先设计好的基因检测panel配合使用而设计, 它们可用于将基础基因检测panel的检测范围扩展至最多100个基因；同时，它们也可用于其他用途，例如检测mRNA分子中的不同基因异构体或核苷酸变异体（这类panel被称为高级定制基因检测panel）。与定制基因检测panel一样，这些额外定制基因检测panel也是通过Xenium Panel Designer软件进行设计的，并且都是根据用户的具体需求定制生产的。需要注意的是，这些额外定制基因检测panel是专为与用户指定的基础基因检测panel配合使用的，因此不建议将它们与其他类型的基因检测面板一起使用。

Xenium数据输出

在完成Xenium实验后，Xenium Onboard Analysis会生成一系列不同的输出文件和文件夹，其中一些文件的详细信息如下所述。查看实验结果并评估其质量的最快捷方法是打开analysis_summary.html文件，该文件包含了各种关键指标及空间信息，可以在任何网页浏览器中查看。此外，从组织层面到单细胞层面，再到转录本水平的各种分析数据都可以在Xenium Explorer软件中直观地显示出来。输出文件中还包含了细胞的位置、形态、分割信息，以及转录本的位置和基因表达情况等处理后的数据。同时，还提供了未经处理的原始数据，包括解码后的转录本计数结果以及实验过程中的细胞形态图像。

• 作为Xenium Onboard Analysis的一部分，每个Xenium实验或fov都会自动生成一系列后续分析文件，其中一些文件也可以在摘要HTML文件中查看，其具体内容在下面有详细说明。需要注意的是，输出文件的内容和格式可能会因所使用的软件版本而有所不同。

• “Decoding”选项卡显示了在Xenium实验中所有基因的转录本总数，其中包括那些位于基础数据集中的基因以及那些位于附加自定义数据集中的基因；这些转录本要么已经被成功识别，要么已经被“解码”，同时还会显示它们的Phred质量评分。被认定为高质量转录本的转录本，其Phred质量评分高于20分；高质量转录本的数量越多，数据的质量也就越高。此外，还显示了每个基因的总表达量，即基础数据集或附加自定义数据集中每个基因的高质量转录本数量（以“每个基因的转录本数量”为单位）。组织样本中的标记基因应显示在基因列表的最上方。

• 细胞分割：通过这个选项卡，我们可以利用多模态细胞分割算法来确定被识别出的细胞数量。该算法结合了三种不同的分割方法：基于ATP1A1/CD45/E-钙粘蛋白的细胞膜染色分析、基于18S分子的RNA染色分析，以及DAPI染色分析（用于观察细胞核）。每个细胞的最终分割结果会按照以下优先级进行确定：(i) 细胞膜染色结果；(ii) 从细胞核向RNA染色区域扩展的情况；(iii) 细胞核的各向同性膨胀程度（膨胀范围为5微米）。与这个选项卡中显示的其他质量控制指标一样，包括细胞大小分布以及每个细胞中检测到的转录本数量，每种算法检测到的细胞比例也会受到组织类型和细胞成分的影响。因此，这些指标需要根据具体的组织类型和实验条件来进行评估。

• Analysis：与之前显示的一些数据类似，这个选项卡也会显示转录本数量的空间分布情况，只不过这次是针对单个细胞而言的。作为Xenium内置分析功能的一部分，算法会根据每个细胞的基因表达情况生成基于图谱的聚类结果。系统会同时显示这些细胞簇的空间分布情况以及它们在UMAP投影图中的表现。在处理TMA样本时，尤其是当样本分散在多个Xenium载玻片上或经过多次实验处理时，这种自动分析方法很可能无法准确反映整个数据集中的细胞簇分布情况。因此，建议在后续处理步骤中对所有Xenium载玻片上的细胞进行聚类分析。

• 图像质量检测：此选项卡显示了在Xenium成像过程中产生的荧光信号，以及细胞分割标记所产生的荧光信号（如果存在的话）。这些缩略图展示了不同成像周期以及不同通道/颜色下的荧光强度。高质量的数据应表现为各周期及各通道之间的荧光强度存在明显差异，这表明荧光信号的特异性较高。如果某个组织区域的荧光强度在各个周期及各个通道中都保持较高水平，那么这很可能是自体荧光的迹象；这种情况可能会影响转录本的检测结果，从而对后续分析产生不良影响。

每次实验/每个fov对应一个结果文件夹：