**摘要：**  
无细胞蛋白合成（cell free system）为难表达蛋白、酶类蛋白、含二硫键蛋白、金属结合蛋白以及需要辅因子参与折叠或发挥功能的蛋白提供了更加灵活的表达优化空间。相比传统细胞内表达体系，无细胞系统具有开放反应环境、变量清晰、可快速定制表达条件等特点，因此越来越多地被应用于高通量蛋白表达筛选、活性蛋白制备以及复杂蛋白折叠优化等方向。本文围绕eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统的添加剂优化策略，系统整理金属离子、有机辅因子、分子伴侣与氧化还原调节剂在蛋白表达过程中的作用机制，并结合嗜热菌蛋白酶、ARG1、AAT、ADH1A与GLuc等案例，分析不同添加剂对蛋白纯化产量、折叠状态与酶活性的影响，为复杂蛋白表达优化与活性蛋白获取提供技术参考。

**关键词：**  
无细胞蛋白合成；无细胞蛋白表达；cell free system；无细胞系统；eProtein Discovery；高通量蛋白表达筛选；全自动蛋白表达筛选；无细胞蛋白表达筛选；活性蛋白；蛋白纯化；金属离子；辅因子；分子伴侣；氧化还原调节剂；二硫键蛋白；难表达蛋白

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# 一、无细胞系统为什么适合做蛋白表达条件筛选？

在蛋白质结构与功能研究中，许多目标蛋白并不是“表达出来”就代表“能够正常发挥功能”。对于酶类蛋白、金属结合蛋白、含二硫键蛋白、易聚集蛋白以及依赖辅因子参与催化反应的蛋白而言，表达环境往往会直接影响其折叠状态、可溶性、纯化得率以及最终生物活性。传统细胞内表达体系虽然已经广泛应用多年，但由于细胞环境本身较为复杂且相对封闭，研究人员很难快速、系统地改变表达体系中的金属离子浓度、氧化还原状态、辅因子种类或分子伴侣组成。因此，在遇到低可溶性、错误折叠、低活性或者蛋白聚集问题时，通常需要反复调整宿主菌株、培养温度、诱导时间、培养基成分以及纯化条件，整体优化周期往往较长。

相比之下，无细胞蛋白合成体系最大的特点之一，是反应环境开放、组分可调且变量更加清晰。研究人员可以直接在表达反应中加入金属离子、有机辅因子、分子伴侣、氧化还原调节剂甚至蛋白酶等成分，并快速观察这些添加剂对蛋白表达、折叠、纯化与活性的影响。eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统便基于这一思路，提供了一套适用于复杂蛋白优化的添加剂组合体系。该系统内置10种经过兼容性验证的添加剂，可与无细胞核心试剂共同使用，并允许研究人员在每一种无细胞混合物中最多组合两种添加剂，从而生成多达55种不同的无细胞混合体系。

在一次标准筛选实验中，24种eGene构建体可与8种不同无细胞混合物并行组合，从而在24小时内生成192种表达条件。通过这一方式，研究人员不仅能够快速判断目标蛋白是否需要辅因子、分子伴侣或氧化还原调节剂参与，还可以进一步筛选出更适合获得正确折叠蛋白、提高纯化得率或增强酶活性的表达条件。对于传统体系中难以处理的复杂蛋白而言，这种开放式筛选策略能够显著减少试错时间。

![eProtein Discovery无细胞系统利用独特无细胞混合物进行蛋白表达，随后开展蛋白纯化与筛选的工作流程](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/7b880489baec7e225f51d6bee3a9bb82.png)

*图1：无细胞技术利用独特无细胞混合物（CFB，Cell-free Blend）进行蛋白表达，随后开展蛋白纯化与筛选的工作流程。模型蛋白分别在不同添加剂组合条件下表达，用于验证金属离子、辅因子、分子伴侣及氧化还原调节剂对蛋白纯化得率和酶活性的影响。*

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# 二、eProtein Discovery添加剂组合如何覆盖不同蛋白折叠需求？

eProtein Discovery系统中的添加剂设计，并不是单纯为了“提高表达量”，而是围绕蛋白正确折叠、维持功能活性、提升可溶性以及模拟特定生理环境展开。对于不同蛋白而言，影响其表达结果的关键因素往往完全不同。有些蛋白依赖金属离子维持结构稳定或催化功能，有些蛋白需要辅因子参与折叠与活化，有些蛋白则容易因为疏水区域暴露而发生聚集，还有一些蛋白则必须在适合的氧化还原环境中才能正确形成二硫键。因此，添加剂体系的真正意义，在于帮助研究人员快速识别目标蛋白所需的表达环境，而不是简单作为“通用增强剂”使用。

目前eProtein Discovery系统中的添加剂组合已经覆盖了大部分复杂蛋白表达优化场景，包括用于促进二硫键形成的氧化还原调节剂、用于帮助蛋白正确折叠的分子伴侣、用于支持金属酶活性与结构稳定性的金属离子、用于参与酶促反应的有机辅因子，以及用于后续标签切除评估的3C蛋白酶等。通过这些添加剂，研究人员能够在同一平台中快速比较不同表达环境对蛋白表达量、可溶性与酶活性的影响，从而避免大量盲目试错。

![eProtein Discovery无细胞系统添加剂选项及其在蛋白表达中的益处](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/ea22f2092f8d4a0a5e0c6d6b63289642.png)

*表1：eProtein Discovery无细胞系统中的添加剂类型及其在蛋白表达优化中的作用。*

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# 三、添加剂选择逻辑：从蛋白结构特征出发，而不是盲目组合

在开展无细胞蛋白表达筛选前，研究人员首先需要分析目标蛋白本身的结构特征与潜在功能需求。例如，如果目标蛋白属于金属酶或金属结合蛋白，则应优先考虑Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺等金属离子是否参与其结构稳定或催化反应；如果目标蛋白属于PLP、NAD、FAD、SAM或Acetyl-CoA依赖型酶，则需要评估相关有机辅因子是否应在表达阶段加入；如果蛋白容易聚集或折叠困难，则应优先测试DnaK等分子伴侣体系；而对于含多个半胱氨酸或二硫键结构域的蛋白，则需要重点关注GSSG、PDI等氧化还原调节体系是否能够改善其折叠结果。

系统中的添加剂决策树，本质上强调的是“根据蛋白结构特征选择表达环境”，而不是随机组合添加剂。由于每种无细胞混合物中最多可添加两种添加剂，因此在筛选时合理设置优先级十分重要。对于部分复杂蛋白而言，单独添加一种成分可能只能部分改善表达结果，而金属离子与辅因子、氧化还原体系与PDI、分子伴侣与特定辅因子之间则可能存在明显协同作用。因此，在完成初步筛选后，研究人员通常还需要围绕最佳组合进一步开展验证。

![无细胞蛋白表达技术添加剂选择决策树](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/15aadc6194647d45c77e905bc026c9d8.png)

*图2：无细胞蛋白表达添加剂选择决策树。每种表达用无细胞混合物中最多可添加两种添加剂，用于帮助研究人员根据蛋白结构特点快速筛选适合的表达环境。*

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# 四、金属离子：金属蛋白与金属酶获得活性的关键条件

据估计，约25%-50%的蛋白质都属于金属结合蛋白。金属离子不仅参与蛋白催化反应，还可能承担结构稳定、构象维持和调控等作用。因此，对于金属酶而言，如果表达环境中缺少关键金属离子，即使蛋白能够表达和纯化，也可能无法获得预期活性。

嗜热菌蛋白酶便是典型案例。该蛋白属于热稳定锌金属蛋白酶，其催化功能依赖Zn²⁺存在，同时还能结合多个Ca²⁺提高热稳定性。研究人员利用eProtein Discovery系统，在不同金属离子条件下表达并纯化该蛋白，并通过荧光底物检测其酶活。实验结果显示，只有在表达阶段加入Zn²⁺时，纯化后的蛋白才能获得明显酶活，而单独添加Ca²⁺并不能提升活性。这说明Zn²⁺在表达阶段便已经参与蛋白正确折叠与活性形成。

![有无锌离子存在时所表达嗜热菌蛋白酶的活性对比](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/cced00108c1ab3ce67b916088139e5cb.png)

*图3：Zn²⁺对嗜热菌蛋白酶表达与酶活性的影响。*

除Zn²⁺外，Mn²⁺同样在部分酶类蛋白中发挥关键作用。研究人员以人精氨酸酶ARG1为模型开展实验，发现仅在表达过程中加入Mn²⁺时，纯化后的ARG1才能获得更高酶活性，其活性约为未添加Mn²⁺条件下的5倍。这说明金属离子不仅参与催化过程，还可能直接影响蛋白折叠和活性构象形成。

![ARG1表达条件与活性对比](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/2e07476a3e0df13c748d61dd55d1effc.png)

*图4：Mn²⁺对ARG1表达与酶活性的影响。*

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# 五、有机辅因子：提升蛋白纯化得率与酶活性的关键变量

许多蛋白除依赖金属离子外，还需要小分子有机辅因子参与结构稳定与功能发挥。例如PLP、NAD、FAD、SAM以及Acetyl-CoA等，均属于常见的酶促反应辅因子。对于这类蛋白而言，即使蛋白能够表达，如果体系中缺少对应辅因子，也可能导致蛋白活性不足或纯化稳定性较差。

研究人员以PLP依赖型酶AAT为模型开展实验，结果显示，在表达阶段加入PLP后，AAT的纯化得率提高约2倍，并且只有在含PLP条件下表达的蛋白才具备明显酶活性。这说明辅因子不仅参与催化反应，还可能直接参与蛋白折叠和稳定性形成。

![含PLP的无细胞混合物可提升AAT的纯化产量与活性](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/bc76618871c7e020c161d6082dd3c6c5.png)

*图5：PLP对AAT纯化得率与酶活性的影响。*

对于同时依赖金属离子和辅因子的蛋白，则需要进一步开展组合筛选。例如乙醇脱氢酶ADH1A同时依赖Zn²⁺和NAD。研究发现，仅在Zn²⁺与NAD共同存在时，ADH1A才能获得最高酶活性。这说明对于复杂酶类蛋白而言，金属离子与辅因子之间往往存在明显协同作用。

![含Zn²⁺与NAD的无细胞混合物是ADH1A实现活性最大化的必要条件](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/cced00108c1ab3ce67b916088139e5cb.png)

*图6：Zn²⁺与NAD组合对ADH1A活性的影响。*

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# 六、分子伴侣：减少蛋白聚集并促进正确折叠

即使在辅因子存在的条件下，部分蛋白仍可能因为折叠困难而发生聚集。分子伴侣的作用，是帮助新生肽链减少错误折叠与疏水暴露，从而提高可溶性表达比例。DnaK（HSP70）是经典分子伴侣之一，其作用机制是结合蛋白暴露的疏水区域，并在DnaJ与GrpE协同作用下促进蛋白正确重折叠。

研究人员利用GLuc荧光素酶作为模型蛋白开展实验。由于GLuc在错误折叠后容易失活，因此非常适合作为分子伴侣效果评估模型。实验结果显示，在含DnaK混合物条件下表达的GLuc，其发光活性明显高于对照组，说明DnaK确实能够帮助蛋白形成更稳定的活性构象。

![含DnaK的无细胞混合物可促进GLuc的折叠并提升其活性](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/83efa4f87fa66a25d3d2ec28a21538da.png)

*图7：DnaK分子伴侣对GLuc折叠与活性的影响。*

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# 七、氧化还原调节剂：含二硫键蛋白获得正确构象的重要因素

对于含二硫键蛋白而言，氧化还原环境会直接影响蛋白是否能够正确折叠。二硫键形成错误时，蛋白往往会出现聚集、失活或结构不稳定问题。PDI与GSSG便是常见的二硫键调节体系，其中PDI负责二硫键重排，而GSSG则提供氧化环境。

GLuc同样是典型二硫键依赖蛋白。研究结果显示，在仅添加GSSG条件下，GLuc活性已经明显提升；而当PDI与GSSG共同存在时，GLuc活性则进一步增强。这说明PDI不仅帮助形成二硫键，还能进一步提高二硫键排列正确性。

![含GSSG与PDI的无细胞混合物可促进GLuc实现最优折叠并提升活性](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/4d42496d52fc8f6c5d986bd1b4858648.png)

*图8：GSSG与PDI对GLuc折叠与活性的影响。*

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# 八、总结：添加剂定制是无细胞蛋白表达筛选的重要优势

从上述案例可以看到，eProtein Discovery无细胞系统的真正价值，并不仅仅是“缩短表达时间”，而是在于能够通过开放式反应体系，对蛋白表达环境进行快速定制化优化。金属离子能够帮助金属酶形成正确活性中心；有机辅因子能够提升辅因子依赖型酶的纯化得率与酶活；分子伴侣能够减少错误折叠和聚集；而氧化还原调节剂则能够帮助含二硫键蛋白形成稳定构象。

对于高通量蛋白表达筛选、全自动蛋白表达筛选以及活性蛋白获取而言，添加剂定制最大的意义，不只是提高蛋白表达量，而是帮助研究人员更快理解目标蛋白对特定折叠环境的需求。尤其是在面对金属酶、辅因子依赖酶、易聚集蛋白以及传统体系中难表达的复杂蛋白时，无细胞系统能够通过开放环境快速定位关键变量，从而为后续结构分析、功能验证、酶学研究以及药物筛选提供更可靠的蛋白样品。

本文基于无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成等应用公开应用文章、文献资料曼博生物整理，用于科研信息分享。


摘要：  无细胞蛋白合成（cell free system）为难表达蛋白、酶类蛋白、含二硫键蛋白、金属结合蛋白以及需要辅因子参与折叠或发挥功能的蛋白提供了更加灵活的表达优化空间。相比传统细胞内表达体系，无细胞系统具有开放反应环境、变量清晰、可快速定制表达条件等特点，因此越来越多地被应用于高通量蛋白表达筛选、活性蛋白制备以及复杂蛋白折叠优化等方向。本文围绕eProtein Discovery无细胞蛋白表达筛选系统的添加剂优化策略，系统整理金属离子、有机辅因子、分子伴侣与氧化还原调节剂在蛋白表达过程中的作用机制，并结合嗜热菌蛋白酶、ARG1、AAT、ADH1A与GLuc等案例，分析不同添加剂对蛋白纯化产量、折叠状态与酶活性的影响，为复杂蛋白表达优化与活性蛋白获取提供技术参考。

无细胞蛋白表达筛选技术解析：eProtein Discovery如何通过金属离子、辅因子与分子伴侣提升活性蛋白制备效率

无细胞蛋白合成（cell free system）为难表达蛋白、酶类蛋白、含二硫键蛋白、金属结合蛋白以及需要辅因子参与折叠或发挥功能的蛋白提供了更加灵活的表达优化空间。相比传统细胞内表达体系，无细胞系统具有开放反应环境、变量清晰、可快速定制表达条件等特点，因此越来越多地被应用于高通量蛋白表达筛选、活性蛋白制备以及复杂蛋白折叠优化等方向。

应用科学家

其他

无细胞蛋白合成系统为复杂蛋白表达提供灵活优化方案，通过金属离子、辅因子、分子伴侣等添加剂组合，显著提升难表达蛋白的产量、折叠正确性和酶活性。该系统适用于金属酶、二硫键蛋白等特殊蛋白的高通量筛选，帮助科研人员快速获得高活性蛋白样品。

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