## 摘要

PEI（Polyethylenimine，聚乙烯亚胺）作为经典阳离子聚合物转染试剂，因成本可控、操作简便以及适合大规模放大等特点，被广泛用于HEK293T、Expi293F、CHO-S等细胞的瞬时转染表达体系中，尤其常用于重组蛋白、单克隆抗体以及病毒载体生产等方向。然而，在实际实验过程中，研究人员经常会遇到转染效率低、蛋白表达量不足、细胞毒性高或者放大后产量下降等问题。本文围绕Polysciences 25kDa线性PEI与PEI MAX（40kDa）体系，对293T、Expi293F以及CHO-S细胞中的PEI转染优化策略进行系统整理，包括细胞状态控制、DNA质量要求、DNA:PEI比例优化、复合物制备细节以及转染后培养条件等关键因素，并结合不同细胞体系给出可参考的标准化优化流程与常见问题排查方案。

**关键词：**  
**Polysciences PEI、PEIMAX、23966、24765、PEI转染试剂、瞬时转染、HEK293T、Expi293F、CHO-S、抗体表达、重组蛋白表达、转染优化**

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## 一、为什么PEI转染体系仍然是主流瞬时表达方案？

在重组蛋白表达与抗体瞬时生产领域，PEI体系至今仍是应用非常广泛的转染方案之一。相比部分商业脂质体转染体系，PEI具有更低成本、更高放大兼容性以及适合悬浮培养体系等优势，因此在实验室研究以及工业级瞬时表达流程中均被大量使用。尤其是在HEK293与CHO体系中，PEI长期被用于抗体表达、病毒包装以及重组蛋白生产等方向。

不过，PEI体系虽然原理相对成熟，但实际实验结果却高度依赖实验细节。很多情况下，转染失败并不是PEI本身的问题，而是细胞状态、DNA质量、复合物形成条件以及培养体系等多个因素共同影响的结果。因此，对于293T、Expi293F以及CHO-S等常用表达体系而言，建立稳定且可重复的PEI优化流程，往往比单纯更换转染试剂更重要。

目前，Polysciences的25kDa线性PEI（23966系列）以及PEI MAX 40kDa（24765系列）已经被大量用于抗体、重组蛋白以及病毒载体生产等方向，并在不同规模表达体系中积累了较多应用经验。

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## 二、PEI转染体系中哪些因素最容易影响转染效率？

PEI转染过程中，影响实验结果的因素很多，但其中最核心的部分通常包括细胞状态、DNA质量、DNA:PEI比例以及复合物制备过程。尤其是在高密度悬浮培养体系中，这些因素之间往往会产生联合作用，因此需要进行系统优化。

### 1. 细胞状态优化

细胞质量是决定转染效率和后续蛋白表达的核心基础。即使使用相同PEI体系，不同细胞状态之间也可能出现数倍表达差异。因此，在PEI转染实验中，通常建议优先确保细胞处于稳定对数生长期，并维持较高细胞活力。

| 优化维度 | 通用要求 | 293T（贴壁） | Expi293F（悬浮） | CHO-S（悬浮） |
|---|---|---|---|---|
| 传代次数 | ≤30 代，避免细胞基因型 / 表型漂移 | 推荐10-25代 | 推荐5-20代 | 推荐10-30代 |
| 细胞活力 | 转染前≥95% | 转染前≥95% | 转染前≥98% | 转染前≥95% |
| 生长阶段 | 严格对数生长期 | 转染时汇合度 70-80% | 转染时密度 2.0±0.2×10⁶ cells/mL | 转染时密度2.0-3.0×10⁶ cells/mL |
| 支原体污染 | 绝对禁止 | 每2周检测一次 | 每2周检测一次 | 每2周检测一次 |
| 复苏后传代 | 至少传代 3 次再用于转染 | 复苏后传代 3-5 次 | 复苏后传代4-6次 | 复苏后传代5-7次 |

在实际实验中，很多研究人员会忽略细胞长期传代带来的表达能力下降问题。尤其对于悬浮细胞而言，如果细胞长期高密度培养或者频繁过度离心，都会影响后续转染结果。因此，建立稳定细胞种子库并保持固定代次实验，通常能够明显提升实验重复性。

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## 三、DNA质量为什么会直接影响PEI转染效果？

PEI转染本质上依赖PEI与DNA形成稳定复合物，因此DNA纯度会直接影响复合物形成效率以及后续细胞摄取能力。如果DNA中存在较高盐离子、RNA、蛋白污染或者内毒素残留，往往会导致复合物不稳定甚至出现细胞毒性增加。

通常建议使用去内毒素质粒提取体系，并确保DNA满足以下要求：

| 项目 | 推荐标准 |
|---|---|
| A260/A280 | 1.8-1.9 |
| A260/A230 | >2.0 |
| 内毒素含量 | <1 EU/μg |
| DNA浓度 | 500-1000 ng/μL |

不同细胞体系对于DNA用量的耐受性也存在差异。

| 细胞系 | 推荐DNA用量（每1×10⁶细胞） | 优化范围 |
|---|---|---|
| 293T | 1.0 μg | 0.5-2.0 μg |
| Expi293F | 1.5 μg | 1.0-3.0 μg |
| CHO-S | 2.0 μg | 1.0-4.0 μg |

对于抗体表达体系而言，重链与轻链比例也会明显影响最终产量，因此通常需要结合具体抗体序列进一步优化。

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## 四、DNA:PEI比例为什么是PEI体系中的关键参数？

在PEI体系中，DNA:PEI比例直接决定复合物粒径、电荷状态以及细胞摄取效率，因此通常被认为是PEI转染体系中的核心优化参数之一。

不同细胞体系推荐的初始优化比例如下：

| 细胞系 | 推荐起始比例（DNA:PEI） | 优化范围 |
|---|---|---|
| 293T | 1:3 | 1:2-1:4 |
| Expi293F | 1:3 | 1:2.5-1:4 |
| CHO-S | 1:2.5 | 1:2-1:3.5 |

通常建议采用矩阵法优化，即固定DNA用量后，对PEI比例进行梯度测试，同时结合转染效率与细胞活力综合评估最优条件。

需要注意的是，不同批次PEI工作液之间可能存在一定差异，因此即使使用相同细胞体系，也建议重新进行比例验证。

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## 五、为什么PEI复合物制备过程会影响实验结果？

很多情况下，转染失败并不是比例本身的问题，而是复合物形成过程不稳定导致的。PEI-DNA复合物的形成对混合顺序、孵育时间以及稀释液条件都比较敏感。

通常推荐使用：

- Opti-MEM
- 无血清培养基
- PBS
- 150mM NaCl

作为复合物稀释体系。

而含有血清、抗生素或者高浓度磷酸盐的体系，则可能明显降低复合效率。

标准制备流程通常包括：

1. DNA与PEI分别稀释至相同体积
2. 将PEI缓慢加入DNA溶液中
3. 轻轻混匀
4. 室温孵育10-15分钟
5. 立即加入细胞体系

其中，“PEI加入DNA”的顺序非常重要，如果顺序颠倒，往往会导致复合物粒径明显增大。

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## 六、不同细胞体系的PEI优化流程参考

### HEK293T贴壁细胞优化流程

293T体系通常适用于快速蛋白表达以及病毒包装实验。转染时推荐细胞汇合度保持在70-80%，并尽量避免细胞过度融合。

一般推荐：

- DNA:PEI = 1:3
- 转染后18-24小时换液
- 72-96小时收样

对于部分耐受低血清体系的293T细胞，也可尝试不换液培养，以减少操作波动。

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### Expi293F悬浮体系优化流程

Expi293F通常用于高密度抗体表达体系。由于悬浮细胞对培养状态更敏感，因此建议在转染前确保细胞活力≥98%。

推荐条件包括：

- 转染密度：1.8-2.2×10⁶ cells/mL
- DNA:PEI = 1:3
- 转染后24小时补料
- 96-120小时收获

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### CHO-S悬浮体系优化流程

CHO-S体系通常用于较长期抗体表达研究。相比293体系，其表达周期更长，但部分抗体表达稳定性更好。

推荐优化策略包括：

- DNA:PEI = 1:2.5
- 转染后24小时降温至31℃
- 分阶段补料
- 120-168小时收获

低温培养往往能够降低代谢压力，从而延长细胞表达周期并提高抗体积累量。

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## 七、PEI转染过程中常见问题如何排查？

PEI体系虽然成熟，但在实际实验中仍然可能出现转染效率低、细胞毒性高或者表达量不足等问题。

| 问题现象 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 转染效率低 | 细胞状态差、DNA质量差、比例错误、复合物制备顺序错误、稀释液中含有血清或抗生素 | 更换低代次细胞，重新优化比例 |
| 细胞大量死亡 | DNA/PEI过量、孵育过久 | 降低用量，缩短孵育时间 |
| 转染率高但表达弱 | 表达载体问题、收样过早 | 更换启动子，延长培养时间 |
| 小试正常但放大失败 | 混合不均匀、通气不足、放大后细胞密度控制不当 | 优化摇瓶条件与混合方式 |

很多情况下，表达问题并不完全来自PEI本身，而是放大过程中培养条件变化导致的。因此，在进行大规模表达前，通常建议先建立稳定的小试放大模型。

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## 八、总结

PEI体系目前仍然是HEK293、Expi293F以及CHO-S等主流瞬时表达体系中的重要工具。相比部分商业瞬转体系，其具有成本可控、适合规模化放大以及工艺成熟等优势，因此在抗体表达、重组蛋白生产以及病毒载体开发中被广泛使用。

不过，PEI转染效率高度依赖实验细节，包括细胞状态、DNA质量、DNA:PEI比例以及培养条件等多个因素。因此，建立稳定且标准化的优化流程，对于提升实验重复性与最终表达产量具有非常重要的意义。

目前，Polysciences PEI以及PEI MAX体系已经被广泛用于293T、Expi293F以及CHO-S等表达平台，并在工业级瞬时表达与科研实验中积累了大量应用经验。

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## 参考文献

1. Stuible M, Burlacu A, Perret S, et al. Optimization of a high-cell-density polyethylenimine transfection method for rapid protein production in CHO-EBNA1 cells[J]. Journal of Biotechnology, 2018, 280: 33-41.

2. Porte M, Stock F, Horry H. Robust and reliable transient protein production with PEIpro®, a well characterized polyethylenimine optimized for transfection[J/OL]. GEN, 2012, 32(5).

3. Construction of a system for rapid evaluation of production enhancer gene in CHO antibody production

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## 关于技术资料来源

本文基于PEI转染试剂、PEI MAX等应用文章、公开资料、参考文献曼博生物整理，用于科研与技术交流、实验参考。

PEI（Polyethylenimine，聚乙烯亚胺）作为经典阳离子聚合物转染试剂，因成本可控、操作简便以及适合大规模放大等特点，被广泛用于HEK293T、Expi293F、CHO-S等细胞的瞬时转染表达体系中，尤其常用于重组蛋白、单克隆抗体以及病毒载体生产等方向。然而，在实际实验过程中，研究人员经常会遇到转染效率低、蛋白表达量不足、细胞毒性高或者放大后产量下降等问题。本文围绕Polysciences 25kDa线性PEI与PEI MAX（40kDa）体系，对293T、Expi293F以及CHO-S细胞中的PEI转染优化策略进行系统整理，包括细胞状态控制、DNA质量要求、DNA:PEI比例优化、复合物制备细节以及转染后培养条件等关键因素，并结合不同细胞体系给出可参考的标准化优化流程与常见问题排查方案。

Polysciences PEI转染优化指南：293T、Expi293F与CHO-S瞬时转染效率及蛋白表达提升策略

PEI（Polyethylenimine，聚乙烯亚胺）作为经典阳离子聚合物转染试剂，因成本可控、操作简便以及适合大规模放大等特点，被广泛用于HEK293T、Expi293F、CHO-S等细胞的瞬时转染表达体系中，尤其常用于重组蛋白、单克隆抗体以及病毒载体生产等方向。然而，在实际实验过程中，研究人员经常会遇到转染效率低、蛋白表达量不足、细胞毒性高或者放大后产量下降等问题。

应用科学家

其他

PEI转染试剂是HEK293T、Expi293F、CHO-S等细胞瞬时转染的主流选择，适用于抗体、重组蛋白及病毒生产。本文系统解析Polysciences PEI与PEIMAX的优化策略，涵盖细胞状态、DNA质量、比例优化及复合物制备等关键因素，提供标准化操作流程与常见问题解决方案，助力提升转染效率与蛋白产量。

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