Science：100多位作者｜Merck：10 种酶多级催化，实现大环肽药物 MK-0616 的颠覆性合成！

Merck 团队开发的生物催化级联反应，通过定向改造酶实现实现口服大环肽 PCSK9 抑制剂 enlicitide（MK-0616，CAS：2407527-16-4）的收敛式、无保护基、公斤级绿色合成；通过7 种工程化酶 + 3 种辅助酶完成肽段拼接、大环环化与还原胺化，总步骤较原工艺减少超 50%，总收率达 39%，终环化浓度从5 g/L 提升至 70 g/L，全程无需色谱纯化，为复杂大环肽药物的低成本、可持续、规模化生产提供颠覆性范式。

image.png

与传统化学合成 43 步路线相比，新方法步骤缩减超一半、无需色谱纯化，多公斤级制备下总收率达39%，解决了复杂环肽合成步骤冗长、保护基操作多、稀释环化产能低、废弃物量大等难题。

DOI: 10.1126/science.aed8713

Enlicitide

Enlicitide decanoate（MK-0616）

• 抑制 PCSK9，降低低密度脂蛋白胆固醇，用于动脉粥样硬化心血管疾病治疗。
• 作为口服大环八肽，3 个稠合大环、8 肽、6 个非天然氨基酸、12 个酰胺键、6 碳连接链，合成难度极高。

临床原有合成路线

• 溶液相合成共 43 步，近一半为保护基修饰操作；
• 线性最长步骤 21 步，钌催化关环复分解需5 g/L 稀溶液抑制寡聚，产能与收率极低；

image.png

生物催化级联

借鉴天然产物生物合成逻辑，通过酶定向改造构建生物催化级联，实现无保护基下的底物偶联，结晶替代色谱纯化，缩减合成步骤、实现吨级规模化生产。

逆合成分析

• 将 enlicitide 逆合成为 Western (2)片段、Eastern (3)片段、Northern (4)片段三个关键中间体；
• 设计核心：中间体具备可结晶性，实现无色谱纯化生产；
• Western (2)、Eastern (3)片段适合化学合成，Northern (4)片段四肽因含 3 个非天然氨基酸、多个氨基亲核位点，依赖酶催化实现区域选择性成键与环化。

image.png

Northern（4）片段的生物催化合成

中间体 9 的合成：筛选改造 ATP-grasp 型连接酶 BaAAL，通过定向进化改造出两种变体（Trp-BaAALEng、Phe-BaAALEng）以引入非天然色氨酸和苯丙氨酸，合成中间体 9，并结合 FbPPK 多聚磷酸激酶实现 ATP 循环再生；

Northern（4）片段：改造羧酸酯酶 RsEstEng，实现 9 区域选择性大环内酰胺化，合成 Northern (4) 片段且无寡聚副产物；

一锅级联反应：双进化型 AAL 酶催化二肽延伸，底物高浓度下液相色谱收率 88%；

52 kg 放大规模：双草酸盐盐分离收率73%，纯度 > 98%。

image.png

片段连接和大环化

中间体 10 的合成：借鉴非核糖体肽合成酶的天然环化机制，筛选改造短芽孢杆菌来源硫酯酶，BlTEEng催化无保护基Eastern (3)片段、Northern (4)片段分子间连接，收率89%，酯水解副产物仅 1.9%；

中间体 13 的合成：构建 KsKRED 酮还原酶 + PsIRED 亚胺还原酶五酶级联，将苄醇氧化为瞬态醛（10→11），后催化分子内亚胺还原，搭配辅因子循环体系，通过还原胺化完成 13 双环骨架构建；

46 kg 放大规模：双盐酸盐结晶分离收率69%，纯度 > 98%。

image.png

片段连接和大环化合成 Enlicitide 1

中间体 14 的合成：化学法选择性屏蔽伯胺，实现二胺中间体与 Western (2) 片段定向偶联；

Enlicitide（1）：改造链霉菌 SsPBP-TEng 硫酯酶，高浓度70 g/L下完成最终大环化合成 Enlicitide (1)，二聚副产物仅 0.1%；

2.5 kg 规模：辛二酸半盐收率 84%，转化为癸酸 enlicitide 收率 92%，纯度 > 99%。

image.png

核心创新点

• 无保护基肽合成：酶的高化学 / 区域选择性避免繁琐保护脱保护。
• 多酶级联一锅化：多酶协同、辅酶自循环、高原子经济性。
• 高浓度大环环化：突破传统稀溶液限制，产能剧增。
• 全结晶纯化：无需色谱，绿色、低成本、易放大