无细胞蛋白表达如何解决复杂转录因子制备难题：eProtein Discovery系统帮你解答

摘要

近年来，无细胞蛋白表达技术正在逐渐成为复杂蛋白、难表达蛋白以及高通量蛋白筛选研究中的重要技术路线。相比传统细胞表达体系，无细胞蛋白合成系统能够有效缩短实验周期，并减少蛋白错误折叠、包涵体形成以及细胞毒性等问题。本文结合复杂转录因子TF L真实研究案例，对eProtein Discovery无细胞蛋白表达平台在复杂蛋白快速制备中的应用进行整理，重点介绍其在转录因子构建体设计、数字微流控自动化筛选、无细胞表达体系优化以及功能验证中的应用价值，并分析无细胞蛋白表达技术在AI蛋白工程、复杂蛋白研究以及功能蛋白开发中的潜力。

关键词：eProtein Discovery、无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成、数字微流控、难表达蛋白、转录因子、蛋白表达系统、复杂蛋白制备、蛋白纯化

一、为什么复杂转录因子难以通过传统体系表达

转录因子（TFs）是调控细胞命运、组织发育以及基因表达网络的重要蛋白，在干细胞多能性维持、神经系统发育、器官发生以及疾病调控中具有重要作用。

但在蛋白研究过程中，部分转录因子由于包含：

• LIM结构域
• 内在无序区域
• 同源结构域
• 锌结合区域

等复杂结构，因此往往难以通过传统细胞表达体系稳定获得。

尤其是在大肠杆菌表达体系中，这类蛋白容易发生：

• 错误折叠
• 包涵体形成
• 蛋白聚集
• 降解增加

等问题。

而昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母表达体系虽然能够部分改善蛋白折叠问题，但仍然存在：

• 周期较长
• 表达量不足
• 纯化复杂
• 功能蛋白得率较低

等局限。

这些问题严重限制了复杂转录因子的结构研究与功能验证。

因此，如何快速获得具有天然功能的复杂蛋白，逐渐成为蛋白工程领域的重要研究方向。

二、eProtein Discovery无细胞蛋白表达平台简介

eProtein Discovery是一种基于数字微流控技术建立的自动化无细胞蛋白表达平台。

该系统能够结合：

• DNA构建设计
• 可溶性标签筛选
• 无细胞混合体系优化
• 自动化表达分析
• 蛋白纯化

等流程，实现复杂蛋白表达条件快速优化。

相比传统细胞表达体系，该平台能够在约48小时内完成：

• DNA导入
• 表达筛选
• 条件优化
• 蛋白纯化
• 功能验证

等完整流程。

系统还能够自动生成大量表达数据，用于分析不同表达条件下蛋白得率与可溶性表现。

三、TF L复杂转录因子研究背景

本次研究围绕复杂转录因子TF L展开。

研究人员分别构建：

• 全长TF L
• 未知功能结构域L2
• DNA结合结构域L3

三种蛋白变体，并利用eProtein Discovery平台开展表达与功能验证研究。

由于TF L包含复杂LIM结构域以及较长无序区域，因此传统表达体系中容易出现错误折叠与蛋白不稳定问题。

研究人员借助系统内置的AlphaFold结构预测工具，对蛋白结构域进行分析，并完成L2与L3结构域设计。

随后，通过密码子优化与可溶性标签构建，建立了24种不同eGene构建体，同时设置无标签对照组，用于后续筛选分析。

四、无细胞蛋白表达体系与自动化筛选流程

本研究采用8种不同无细胞混合体系，并在基础翻译体系中加入：

• Zn²⁺
• 分子伴侣DnaK
• 二硫键促进剂
• 氧化还原体系
• 3C蛋白酶

等组分。

由于TF L含有多个富含半胱氨酸的LIM结构域，因此Zn²⁺对于维持蛋白稳定性具有重要作用。

研究人员随后将：

• 24种eGene构建体
• 8种无细胞混合体系
• 纯化磁珠
• 空白样品
• 洗脱缓冲液

共同加载至数字微流控卡盒中。

系统能够自动完成192组表达条件分析，并筛选高表达组合用于后续纯化。

整个流程约24小时即可完成。

eProtein Discovery系统流程图

图1：eProtein Discovery系统流程图。系统可在48小时内完成从DNA到功能蛋白制备的完整流程。

TF L变体的AlphaFold结构预测

图2：TF L变体的AlphaFold结构预测，包括全长TF L及L2、L3结构域设计结果。

eGene构建体与无细胞混合体系筛选结果

图3：eGene构建体与无细胞混合体系筛选结果，包括可溶性标签设计及无细胞体系优化结果。

五、复杂转录因子表达结果与蛋白纯化分析

研究结果显示，eProtein Discovery平台能够有效提高复杂转录因子的表达效率。

在Top30表达条件中，所有高表达构建体均包含可溶性标签。

其中：

• 全长TF L与L2更适配P17标签
• L3更适配CUSF标签

相比无标签体系，蛋白表达量提高约1.83倍。

此外，Zn²⁺以及氧化还原体系同样显著改善了蛋白表达效果。

研究结果表明：

• GSSG可提高全长TF L表达量
• PDI⁺/GSSG体系可明显提升L2与L3表达效率

说明氧化环境对于复杂蛋白正确折叠具有重要作用。

随后，研究人员利用优化后的表达体系完成过夜放大培养，并成功获得微克级TF L蛋白。

SDS-PAGE与Western Blot分析结果均显示蛋白表达与纯化成功。

TF L变体的表达与纯化结果

图4：TF L变体的表达与纯化结果。

eProtein Discovery系统放大生产结果

图5：eProtein Discovery系统放大生产结果。

六、DNA结合实验验证蛋白天然功能

为了进一步验证蛋白功能活性，研究人员开展了DNA结合EMSA实验。

结果显示：

• 全长TF L能够与DNA探针形成浓度依赖性结合
• L3结构域能够形成特异性DNA复合物
• 阴性对照组未观察到明显结合现象

说明系统获得的蛋白能够保留天然DNA结合功能。

此外，L2结构域未表现出明显DNA结合能力，也提示其可能承担其他结构调控作用。

这些结果进一步证明，无细胞蛋白表达平台不仅能够实现复杂蛋白快速制备，同时还能维持蛋白天然功能状态。

DNA结合EMSA实验结果

图6：DNA结合EMSA实验结果，包括全长TF L以及L2、L3结构域DNA结合能力分析。

七、无细胞蛋白表达技术的应用价值

随着AI蛋白工程、de novo蛋白设计以及复杂功能蛋白研究不断发展，无细胞蛋白表达技术正在逐渐成为蛋白研究领域的重要工具。

相比传统细胞表达体系，无细胞蛋白表达平台具有：

• 周期短
• 自动化程度高
• 表达条件可快速优化
• 更适合复杂蛋白
• 更适合高通量筛选

等特点。

目前，这类技术已经逐渐应用于：

• 转录因子研究
• 膜蛋白研究
• 复杂酶工程
• AI蛋白设计
• 功能蛋白开发
• 靶向药物研究
• 再生医学

等多个方向。

未来，随着自动化筛选与AI蛋白设计进一步融合，无细胞蛋白表达平台预计将在蛋白工程领域发挥更重要作用。

八、总结

eProtein Discovery无细胞蛋白表达平台通过结合数字微流控与自动化筛选技术，为复杂转录因子与难表达蛋白研究提供了新的解决方案。

本研究成功完成：

• TF L构建体设计
• 无细胞体系优化
• 自动化表达筛选
• 微克级蛋白制备
• DNA结合功能验证

等完整流程，并证明无细胞蛋白表达技术能够有效解决复杂蛋白传统表达难题。

随着复杂蛋白研究需求不断增长，无细胞蛋白表达平台预计将在未来生命科学研究与蛋白工程领域发挥越来越重要的作用。

关于技术来源

本文基于eProtein Discovery、无细胞蛋白表达、无细胞蛋白合成、cell-free system等公开资料、参考文献、应用文章等曼博生物整理，用于科研技术交流和实验、研发参考。