人原代肝细胞PHH与肝非实质细胞应用解析：药物代谢、肝毒性检测与MASH模型研究

摘要： 人原代肝细胞（PHH）和人肝非实质细胞是药物代谢、肝毒性检测、药物相互作用研究以及肝病机制研究中的重要体外模型。本文围绕人原代肝细胞选型标准、不同贴壁周期细胞的应用场景、Kupffer细胞、肝星状细胞、肝内皮细胞等肝非实质细胞特点，以及复苏、铺板、维持培养等标准化操作流程进行整理，为ADME、DILI、MASH模型和体外肝脏模型研究提供参考。

关键词：人原代肝细胞、PHH、人肝非实质细胞、Kupffer细胞、肝星状细胞、肝内皮细胞、肝细胞培养基、药物肝毒性检测、MASH模型、体外肝脏模型

一、人原代肝细胞选型主要标准

人原代肝细胞是药物研发中评估代谢稳定性、肝毒性和药物相互作用的重要体外模型。相比永生化细胞系或部分诱导分化模型，人原代肝细胞能够更接近人体肝脏真实代谢状态，因此在ADME研究、CYP酶活性评价、药物清除率测定、药物酶诱导以及体外肝毒性检测中具有较高参考价值。选择人原代肝细胞时，通常需要重点关注复苏后细胞存活率、贴壁能力、CYP450酶活性、代谢功能保持情况、批次间性能稳定性、供体信息完整度以及是否具备疾病背景资料等因素。对于需要开展NAFLD、MASH、肝纤维化或年龄相关性药物代谢差异研究的项目，供体临床背景、病理评分、BMI、肝功能指标和组织学图像等信息也会直接影响模型适配性。

从实验设计角度看，优质人原代肝细胞不仅需要在复苏后保持较高活率，还应具备较好的贴壁表现和稳定代谢功能。对于短期代谢实验，研究人员更关注细胞复苏后快速进入实验状态的能力；对于长期肝毒性研究、酶诱导研究和器官芯片等复杂培养体系，则需要细胞在更长培养周期内维持稳定形态、代谢酶活性和功能响应。因此，人原代肝细胞选型并不是简单比较存活率，而是需要结合实验周期、检测终点、疾病模型需求和后续培养体系进行综合判断。

二、肝脏细胞资源与质量控制要点

人原代肝细胞及肝非实质细胞的价值，很大程度上取决于供体资源覆盖范围和质量控制体系。理想的肝脏细胞资源应覆盖不同年龄阶段，包括新生儿、儿童、青少年及成人来源细胞，以便支持儿科药物研发、年龄相关性代谢差异研究和成人药物代谢评价。同时，对于肝病机制研究和疾病模型构建而言，健康供体细胞与疾病状态供体细胞同样重要，例如不同阶段MAFLD/MASH、脂肪肝、肝硬化等背景细胞可用于建立更贴近特定疾病状态的体外模型。

在复杂肝脏模型研究中，同一供体来源的匹配细胞资源具有较高应用价值。肝实质细胞、肝非实质细胞以及对应肝组织样本如果来自同一供体，可减少供体差异对实验结果的干扰，更适合用于共培养体系、器官芯片、肝纤维化模型、炎症模型以及肝脏微环境研究。对于药物代谢和肝病机制研究而言，这种同源匹配资源有助于提高模型一致性和数据解释能力。

细胞贴壁周期也是选型时需要关注的关键指标。短期贴壁型人原代肝细胞通常可稳定培养1至4天，适用于快速代谢实验、清除率测定和短期毒性评价；中期贴壁型细胞可稳定培养5至9天，更适合酶诱导研究、药物相互作用研究以及部分复杂培养体系；长期贴壁型细胞可稳定贴壁至10至14天，更适合慢代谢化合物研究、长期毒性检测和需要较长观察窗口的体外肝脏模型。不同贴壁周期并不存在绝对优劣，关键是与实验目的相匹配。

质量控制方面，每批人原代肝细胞通常需要经过复苏活率、产量、贴壁率、主要代谢酶活性和供体背景等多维度检测。常见检测内容包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP3A4等主要代谢酶活性，部分细胞批次还可提供多种代谢酶和肝病相关基因分型信息，以及供体病史、BMI、肝功能指标和病理学评分。对于细胞培养与药物研发实验而言，完整CoA和供体资料有助于提高实验可追溯性，也便于研究人员根据项目需求筛选更合适的细胞批次。

三、人原代肝细胞PHH的主要类型与应用场景

人原代肝细胞是药物研发中使用广泛的肝脏细胞模型。根据贴壁能力、培养周期和供体背景不同，可分为成人悬浮型、短期贴壁型、中期贴壁型、长期贴壁型、高BMI/MAFLD/MASH背景细胞以及新生儿、儿童、青少年来源肝细胞等类型。不同类型PHH对应不同实验场景，研究人员在选择时应优先根据实验终点和培养周期判断。

成人悬浮型与短期贴壁型人原代肝细胞更适合药物代谢稳定性、内在清除率测定和短期代谢实验。这类细胞通常经过主要I相和II相代谢酶活性表征，可用于快速评价化合物代谢行为。短期贴壁型细胞可稳定培养1至4天，适用于不需要长时间维持培养的实验流程。

成人中期与长期贴壁型人原代肝细胞更适合药物酶诱导、药物相互作用和长期肝毒性检测。中期贴壁型细胞通常可维持5至9天，长期贴壁型可维持10至14天，可支持研究人员在较长培养窗口内观察CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4等代谢酶对诱导剂的响应。对于慢代谢化合物或需要多次给药处理的DILI研究，长期贴壁能力是提高模型可用性的关键条件。

高BMI、MAFLD和MASH背景人原代肝细胞适用于脂肪性肝病机制研究、MASH模型构建和相关药物筛选。这类细胞通常来自不同疾病阶段供体，包括脂肪变性、MASH和肝硬化等状态，并可提供NAS评分、纤维化分期及H\&E/三色染色图像等资料。对于希望在更接近疾病背景的体外系统中评价候选药物的研究人员而言，这类细胞可帮助提高模型相关性。

新生儿、儿童和青少年来源人原代肝细胞主要用于儿科药物研发和年龄相关性代谢差异研究。不同发育阶段肝脏中药物代谢酶表达谱和成熟度存在差异，因此儿童来源细胞能够为儿科药物剂量设计、药物安全性评价和发育相关代谢研究提供更合适的体外模型。

成人原代肝细胞

图1. 成人原代肝细胞（左：复苏后明场；右：培养第4天相差显微镜图像）

四、人肝非实质细胞在肝脏模型中的作用

肝脏非实质细胞约占肝脏细胞总数的30%至40%，虽然数量少于肝实质细胞，但在肝脏稳态维持、免疫调节、炎症反应、血管微环境和纤维化进程中发挥重要作用。随着体外肝脏模型从单一肝细胞培养逐渐发展为共培养、三维培养和器官芯片系统，肝非实质细胞的应用价值越来越突出。

Kupffer细胞是肝脏固有免疫细胞，主要参与炎症反应、吞噬作用和肝脏免疫调节。该类细胞可用于肝脏免疫研究、炎症性肝病模型和药物诱导炎症反应评价。Kupffer细胞通常不增殖、无法传代，复苏后直接用于实验，可维持培养至约7天。其功能验证常涉及脂多糖（LPS）诱导的细胞因子响应，用于确认细胞炎症反应能力。

人原代肝星状细胞是肝纤维化研究中的重要细胞类型。肝星状细胞在静息状态下参与维生素A储存和肝脏稳态维持，而在肝损伤或炎症刺激下可被激活，并转化为肌成纤维样细胞，参与细胞外基质沉积和纤维化进展。因此，肝星状细胞常用于肝纤维化机制研究、抗纤维化药物筛选和肝病模型构建。该类细胞通常可进行有限传代，实验中建议使用早期传代细胞，以减少表型漂移。

人原代肝内皮细胞主要参与肝脏微循环、物质交换、血管生成和肝窦结构维持。肝内皮细胞可用于肝脏血管生成研究、药物转运研究、肝脏屏障功能研究和肝脏微环境模型构建。该类细胞通常需要通过流式细胞术或特异性标志物检测确认表型，以保证模型可靠性。

五、配套培养基与标准化操作流程

人原代肝细胞对复苏、铺板和维持培养条件较为敏感。为了获得稳定细胞性能，通常需要配套使用复苏培养基、铺板培养基和维持培养基。复苏培养基主要用于降低冻存复苏过程中的细胞损伤，铺板培养基用于帮助细胞快速贴壁并恢复形态，维持培养基则用于后续实验周期内维持细胞功能和代谢活性。不同培养基在应用阶段上具有明确分工，混用或替代可能影响贴壁率、形态恢复和后续功能表现。

LifeNet Health人原代肝细胞培养基清单

图2. 人原代肝细胞培养基清单

以冻存人原代肝细胞为例，细胞签收后应立即转移至气相液氮中长期储存，推荐储存温度通常在-135℃至-190℃范围内。冻存细胞不建议长时间置于室温或干冰环境中，以免造成标签开裂、温度波动和细胞活性下降。培养基验收后，复苏、铺板和维持培养基基础液通常置于2℃至8℃保存，补充剂则按照说明置于-20℃保存。

复苏前，应提前20至30分钟将复苏培养基置于37℃水浴预热。从液氮中取出冻存管后，应在37℃水浴中快速解冻约90至100秒，直至仅剩少量冰晶。随后用70%酒精擦拭冻存管外部，将细胞悬液转移至含预热复苏培养基的离心管中，并在室温下以100×g离心8分钟。离心后轻轻吸弃上清，加入预热铺板培养基，轻柔重悬细胞沉淀，再进行细胞计数、活率和产量评估。

铺板时，应参考每批次CoA推荐接种密度，用铺板培养基调整细胞浓度，并将细胞悬液加入胶原蛋白包被的培养板中。细胞进入37℃、5% CO₂培养箱后，可按照“南北向、东西向、8字形”的方式轻轻摇晃培养板，使细胞均匀分布。培养前60分钟内，每隔约15分钟重复轻柔摇晃一次，有助于提高细胞铺板均一性。接种后2至4小时可吸出培养液，更换为预热的维持培养基。后续培养过程中通常每天更换新鲜维持培养基，直至实验结束。

六、常见问题FAQ

Q1：人原代肝细胞的供体筛选需要关注哪些信息？

人原代肝细胞供体筛选通常需要关注完整病史、社会史、肝功能指标、BMI、疾病背景、组织病理学结果以及相关病原体检测结果。对于药物代谢研究，供体年龄、性别、用药史和代谢酶基因型可能影响实验结果；对于MASH或肝纤维化研究，NAS评分、纤维化分期和染色图像等信息更具参考价值。每批细胞配套的CoA和供体信息越完整，越有利于研究人员进行实验设计和结果解释。

Q2：不同类型人原代肝细胞应该如何选择？

如果实验目标是快速代谢稳定性评价或内在清除率测定，可优先选择成人悬浮型或短期贴壁型人原代肝细胞；如果实验目标是药物酶诱导、药物相互作用或长期肝毒性检测，则更适合选择中期或长期贴壁型细胞；如果研究方向是MAFLD/MASH或脂肪肝药物筛选，可选择高BMI、MAFLD或MASH背景供体细胞；如果关注儿科药物研发或年龄相关代谢差异，则应选择新生儿、儿童或青少年来源肝细胞。

Q3：肝非实质细胞可以传代吗？

不同类型肝非实质细胞的传代能力不同。Kupffer细胞通常不增殖、无法传代，复苏后应直接用于实验，可在适宜条件下维持培养一定时间。肝星状细胞和肝内皮细胞通常可以进行有限传代，一般建议使用早期传代细胞开展实验，以减少细胞状态变化和表型漂移对结果造成影响。

七、总结

人原代肝细胞及肝非实质细胞是药物研发和肝病机制研究中不可或缺的体外模型。PHH可用于药物代谢稳定性、清除率测定、CYP酶诱导、药物相互作用和DILI检测；Kupffer细胞、肝星状细胞和肝内皮细胞则可从免疫、纤维化、血管微环境等角度补充肝脏模型信息。随着ADME、MASH、器官芯片和复杂共培养体系的发展，研究人员对细胞来源、供体背景、功能表征和标准化操作流程的要求正在持续提高。

在实际实验中，选择合适类型的人原代肝细胞、明确贴壁周期、结合供体病理背景，并配套规范的复苏、铺板和维持培养流程，是提高实验重复性和模型可靠性的关键。对于需要构建更接近人体肝脏微环境的研究体系而言，将肝实质细胞与肝非实质细胞进行合理组合，也将成为体外肝脏模型发展的重要方向。

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