**摘要：**杂交瘤细胞融合后进入HAT选择培养，是单克隆抗体制备中决定阳性克隆能否顺利建立的关键阶段。实验中常见两类问题：一种是融合后24~48小时内大量细胞死亡、几乎看不到有效细胞团；另一种是早期仍能观察到存活细胞，但培养至第5~7天后集落逐渐稀疏甚至消失。两类现象的排查方向并不相同，前者更需要关注PEG融合操作和亲本细胞状态，后者则更多涉及HAT选择压力、HGPRT缺陷稳定性、铺板密度、饲养层、血清及培养条件。本文按照问题出现时间梳理杂交瘤HAT筛选中集落生长不良的7项排查要点，并结合对照设计和验证方法，帮助区分融合效率问题、选择体系问题和低密度生长支持不足。

**关键词：杂交瘤、HAT筛选、促杂交瘤生长剂、杂交瘤细胞、集落生长不良、HGPRT缺陷、PEG细胞融合、骨髓瘤细胞、饲养层、单克隆抗体、杂交瘤生长剂**

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## 一、先判断问题发生在融合后早期，还是HAT筛选中后期

杂交瘤实验出现“孔内几乎没有集落”时，最容易犯的错误是直接把所有原因归到HAT培养基本身。实际上，真正有效的排查应该先根据问题出现的时间进行分类，因为融合后24~48小时就出现大量细胞碎片，与培养第5~7天以后集落逐渐消退，背后的原因往往完全不同。

第一类情况是**融合后早期存活失败**。这类样本通常在融合后24~48小时就能观察到大量细胞碎片，活细胞团很少，此时重点应该检查PEG融合条件、亲本细胞状态、融合时细胞活率和整个操作过程，而不是首先怀疑HAT选择压力。

第二类情况是**筛选期集落消退**。这类样本在培养前2~3天通常仍然能够观察到一定数量的存活细胞，但到了第5~7天以后，集落没有继续扩大，反而逐渐稀疏甚至消失，此时更应该关注HAT培养基质量、骨髓瘤细胞HGPRT状态、铺板密度、培养基营养条件以及生长支持体系。

| 分类 | 典型表现 | 主要排查方向 |
| :---: | :---: | :---: |
| 融合后早期存活失败 | 融合后24~48 h出现大量细胞碎片，活细胞团少 | 融合操作、亲本细胞状态 |
| 筛选期集落消退 | 前2~3天仍有活细胞，第5~7天后集落逐渐稀疏甚至消失 | HAT选择压力、培养体系、铺板密度 |

**表1：两类杂交瘤细胞生长不良的典型表现和主要排查方向**

因此，建议每次融合后24小时固定进行一次镜检，并记录活细胞数量、细胞碎片比例和明显细胞团数量。这个时间点的数据非常重要，因为后续即使第7天几乎没有集落，也可以通过早期记录判断问题到底发生在融合阶段，还是发生在后续HAT筛选和低密度培养过程中。

## 二、排查要点1：先确认融合效率，而不是只看最后有多少集落

细胞融合本身就是一个效率相对有限、同时对实验参数比较敏感的过程。PEG分子量和批次、PEG加入和稀释速度、作用时间、融合时两类亲本细胞比例、细胞密度以及融合前的细胞状态，都可能影响最终成功形成的杂交细胞数量。如果融合阶段已经损失了大量有效细胞，那么后面的HAT培养条件即使完全正常，也很难得到足够数量的阳性集落。

因此，不建议仅根据第7天或者第10天看到多少集落来反推“融合效率高不高”。更加有效的方法是在融合完成以后记录总活细胞数、细胞碎片情况和疑似融合细胞团数量，并与实验室历史成功批次进行比较。如果过去成功批次融合后24小时能够观察到大量状态较好的细胞，而当前批次已经出现明显碎片增加，就应该优先回查PEG处理步骤和亲本细胞质量。

为了减少批次波动，PEG批号、作用时间、加入顺序和稀释节奏最好纳入固定SOP。骨髓瘤细胞也不建议在融合当天临时从状态较差的培养瓶中直接使用，更合适的做法是提前复苏和传代，使其在融合当天处于稳定对数生长期。两类亲本细胞在融合前24小时都应确认活率和生长状态，这一步通常比后期不断调整HAT培养基更容易真正找到问题。

## 三、排查要点2：骨髓瘤细胞的HGPRT缺陷是否仍然稳定

HAT选择能够发挥作用，依赖于骨髓瘤亲本细胞稳定保持HGPRT缺陷。因此，如果骨髓瘤细胞长期连续传代、细胞库管理不规范或者缺少必要的选择压力，HGPRT缺陷表型发生变化，就可能直接影响整个HAT筛选结果。

HAT培养基中的氨基蝶呤通过抑制二氢叶酸还原酶（DHFR），阻断嘌呤和嘧啶的从头合成途径。正常细胞可以利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷走补救合成途径，其中嘌呤补救依赖HGPRT，而胸腺嘧啶脱氧核苷则通过胸苷激酶相关途径参与DNA合成。HGPRT缺陷的骨髓瘤细胞由于缺少有效的嘌呤补救能力，在HAT环境中无法维持DNA合成，因此逐渐死亡；而成功融合的杂交细胞则可以从B细胞一侧获得相应代谢能力，同时保留骨髓瘤细胞较强的增殖能力，因此能够在HAT条件下存活。

![HAT筛选的原理](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/003c1b07e8970e0c3b6d023afcb9b0a0.png)

**图1：HAT选择培养的基本原理**

如果骨髓瘤细胞长期传代后出现HGPRT阳性回复细胞，这部分细胞就可能在HAT培养基中继续存活，形成并非真正目标杂交细胞来源的集落，从而干扰后续筛选判断。比较直接的验证方法，是将待使用的骨髓瘤细胞单独铺板，并在HAT培养基中连续培养约10~14天。如果仍然存在能够持续生长的细胞，就需要考虑HGPRT缺陷表型是否已经不稳定。

对于已经出现这类问题的细胞群，可以根据实验室原有体系使用8-氮杂鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤进行重新筛选，并通过规范的主细胞库和工作细胞库管理减少长期连续传代带来的表型漂移。

## 四、排查要点3：HAT培养基不是“加进去就一定有效”，还要验证实际选择压力

如果融合后早期细胞状态正常，但进入HAT培养以后集落持续减少，就需要开始检查培养基本身。HAT体系中的不同成分承担的作用不同，因此配制、储存和使用过程中的偏差可能导致选择压力过强或者过弱。

比较常见的第一种情况是氨基蝶呤有效浓度偏高。选择压力过强时，不仅未融合骨髓瘤细胞受到抑制，刚刚形成、状态本身就不稳定的杂交瘤细胞也可能承受过大代谢压力，最终表现为整个培养板中集落都很少。

第二种情况是次黄嘌呤配制或者溶解出现问题。原始资料特别提醒，次黄嘌呤溶解度相对较低，如果粉末没有充分溶解，实际进入培养体系的有效浓度可能低于预期。相比之下，胸腺嘧啶脱氧核苷水溶性较好，通常不容易出现同样程度的溶解问题。

第三种情况则发生在筛选中后期。即使HAT初始配方没有问题，如果培养时间较长但换液不及时，基础培养基中的营养物质逐渐消耗，同时代谢废物、pH和渗透压等条件不断变化，也会限制本来已经处于低密度状态的杂交瘤集落继续扩增。

判断问题是否来自HAT培养基本身，一个比较实用的办法是使用一株已知能够稳定耐受HAT条件的杂交瘤细胞，在同一批待验证培养基中平行培养并记录生长曲线。如果对照细胞同样表现明显异常，就更支持问题来自培养基；如果对照细胞生长稳定，而新融合体系仍然大量死亡，则应该继续排查融合效率、铺板密度和细胞支持条件。

## 五、排查要点4：铺板密度过高和过低都可能造成集落不良

杂交瘤筛选阶段的细胞密度并不是越低越利于获得单克隆。新融合细胞的状态通常比较脆弱，而且低密度条件下细胞自身释放的促生长因子容易被稀释。如果每个孔中的有效细胞数量过少，细胞间旁分泌支持不足，就可能出现早期仍有单个细胞存活，但始终无法形成稳定扩增集落的情况。

相反，铺板密度过高也会造成问题。大量细胞堆积会增加营养和空间竞争，同时提高代谢废物积累速度，使整个孔内环境更快恶化。因此，同一实验体系最好不要只使用一个经验密度，而可以在正式实验前设置3个铺板密度梯度进行平行培养，并在第7天比较集落数量、集落大小和孔内总体细胞状态，以确定更加稳定的范围。

96孔板还存在明显的边缘效应。外圈孔由于蒸发更快，培养液体积和渗透压更容易发生变化，因此常常表现出比中心孔更差的生长状态。

![96孔板边缘效应](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/eb13b3d49999618e27489103ad6f3426.png)

**图2：96孔板培养中的边缘效应**

如果发现同一块板中中心孔集落状态正常，而边缘孔明显偏差，就不应该首先怀疑融合效率。可以通过维持培养箱湿度、将培养板置于合适的带盖透气环境、在旁边放置无菌水源，或者直接将最外圈孔只加入PBS或培养基、不用于正式接种等方式减少蒸发影响。

## 六、排查要点5：饲养层本身也可能成为新的实验变量

饲养层的主要作用是为新融合细胞或低密度单细胞提供细胞因子和代谢支持。腹腔巨噬细胞等细胞常被用于杂交瘤培养中的生长支持，但这类体系本身也会引入额外变量，包括细胞来源、制备状态、灭活程度和批次差异。

如果饲养层状态良好，它可以帮助提高低密度杂交瘤细胞的存活和集落形成概率；但如果饲养层制备质量不稳定，也可能产生相反效果，例如竞争营养、改变培养环境或者带来不同批次间难以控制的生长差异。

因此，遇到集落数量偏少时，不建议直接得出“需要更多饲养层”的结论。更适合的验证方式是设置“加饲养层”“不加饲养层”和“加入化学成分限定生长补充剂”三组平行实验，在相同融合细胞、相同铺板密度和相同HAT条件下比较最终集落数量和生长状态。如果饲养层并没有带来稳定优势，就应该考虑是否值得继续保留这个额外操作步骤。

对于希望减少动物来源变量的体系，也可以考虑成分明确的杂交瘤生长补充剂，或者使用甲基纤维素半固体培养体系，使筛选和物理克隆分离更加容易标准化。

## 七、排查要点6：血清批次和基础培养基状态可能比想象中更重要

杂交瘤筛选和低密度克隆阶段对培养环境变化比较敏感，而胎牛血清本身存在天然批次差异。不同批次中的生长因子、脂质、蛋白和其他成分组成并不完全一致，因此即使品牌和标称规格相同，也可能出现某一批血清支持集落生长较好，而另一批明显偏差的情况。

如果怀疑血清问题，可以使用同一批冻存杂交瘤细胞，在其他条件完全相同的情况下仅更换血清批次进行平行培养。这样得到的结果比直接更换一整套培养基体系更容易解释。

谷氨酰胺稳定性同样需要关注。普通谷氨酰胺在37℃培养过程中会逐渐降解，如果培养基配制以后长期放置，或者筛选时间较长，可能进一步影响快速分裂细胞的营养状态。可以根据实验室体系采用现配现加或者使用更稳定的谷氨酰胺衍生物。

抗生素也不建议随意提高浓度。新融合细胞本来就处于较高压力状态，如果为了“保险”而明显超过推荐工作浓度，可能进一步降低细胞生长表现。

## 八、排查要点7：一些看起来不起眼的操作偏差，累积后可能直接影响存活率

杂交瘤实验包含多个连续的细胞操作步骤，其中很多偏差单独看并不严重，但当多个小问题叠加以后，就可能使本来已经较脆弱的新融合细胞进一步失去存活能力。例如离心转速过高、离心时间过长、PEG稀释时吹打过强、接种过程中细胞反复暴露在培养箱外，以及培养箱温度、湿度和CO₂长期波动，都可能逐步影响最终集落形成。

这类问题最有效的排查方式通常不是立即更换试剂，而是把当前实验记录与实验室历史成功批次进行逐项比较。尤其应该检查离心条件、PEG加入和稀释时间、每一步在室温环境中的停留时间、接种体积以及培养箱开关频率。如果条件允许，可以对离心、过滤或者接种这些关键步骤设置小规模平行对照，从而判断具体是哪一个操作变量造成差异。

一旦确认是操作流程导致的问题，更有效的解决方案通常是标准化，而不是不断更换培养基。把离心参数、PEG操作、接种动作和时间节点写入SOP并固定下来，往往能够明显减少不同实验人员和不同批次之间的结果波动。

## 九、排除流程问题以后，为什么还要单独考虑筛选阶段的生长支持

流程排查和生长支持解决的不是同一个问题。HAT选择阶段的主要压力来自代谢通路受到限制，而单细胞或低密度培养阶段的主要限制则是细胞缺少足够的旁分泌支持和增殖信号。即使HAT配方完全正常、融合过程也没有明显异常，新形成的杂交瘤仍然可能因为低密度状态下生长支持不足而无法顺利形成集落。

对于这类情况，可以考虑增加适合的生长支持条件。Hybriboost是一种化学成分限定的杂交瘤生长补充剂，其设计用途是为新融合细胞提供与增殖和低密度生长相关的营养与信号支持，可与DMEM、RPMI-1640等基础培养基以及HAT选择体系配合使用，并适用于NS-1、SP2/0等常见小鼠骨髓瘤融合体系。

![Hybriboost促杂交瘤细胞生长剂](https://developer.qcloudimg.com/http-save/yehe-12003223/429eb0d6ce5f94658368b3f3fcafc6e1.png)

**图3：化学成分限定的杂交瘤细胞生长补充剂示意**

需要强调的是，生长补充剂不应该被用来掩盖明显的系统错误。如果融合效率本身很低、骨髓瘤细胞HGPRT状态已经异常或者HAT培养基选择压力明显失衡，仅增加生长支持并不能从根本上解决问题。更加合理的顺序仍然是：**先排查融合和筛选体系，再评价是否需要额外生长支持。**

## 十、7项排查可以按照什么顺序进行

如果HAT筛选结果明显异常，不建议一次性同时更换多个条件，否则下一轮实验即使成功，也很难知道真正解决问题的是哪个因素。可以按照问题出现的时间顺序进行排查：

1. **先看融合后24~48小时的细胞状态。** 如果这一阶段已经出现大量细胞碎片，应优先回查融合操作和亲本细胞。
2. **确认骨髓瘤细胞HGPRT缺陷是否稳定。** 可以单独进行HAT耐受性验证，排除亲本细胞表型漂移。
3. **验证HAT培养基本身。** 使用稳定HAT耐受杂交瘤细胞作为培养基阳性对照。
4. **测试铺板密度。** 使用同一批融合细胞设置多个密度梯度，并同时观察边缘孔效应。
5. **评价饲养层是否真正有效。** 将饲养层与成分限定补充剂设置为平行对照。
6. **检查血清和基础培养基。** 尽量一次只改变一个批次或一个成分。
7. **最后回查操作记录。** 重点比较离心、PEG处理、接种和培养箱条件是否与成功批次一致。

这种顺序的优势在于可以从最早发生的环节开始排除问题，避免在一个本身已经失败的融合体系上不断修改后续培养条件。

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## 十一、常见问题说明

### Q1：HAT筛选后整块板都没有细胞存活，还有必要继续培养吗？

如果整个培养板已经没有任何可见存活细胞或集落，通常很难从原板直接恢复有效杂交瘤。此时更适合停止继续消耗培养时间，先使用小规模平行实验验证亲本细胞状态、融合操作和HAT体系是否正常，再重新进行正式融合。尤其建议保留融合后24小时记录，以判断问题是发生在早期融合阶段还是后续筛选阶段。

### Q2：集落数量很少，但检测到的阳性率反而比较高，需要重新做融合吗？

集落数量少但阳性率较高，通常说明选择体系仍然具有一定有效性，主要问题更可能出在有效存活细胞数量或低密度生长支持不足，而不一定是HAT选择特异性失效。可以优先优化铺板密度、生长支持和培养环境，同时将已经获得的阳性克隆尽早扩增和建库，降低后续培养过程中丢失的风险。

### Q3：HAT培养基里可以同时加入杂交瘤生长补充剂吗？

如果使用的是与HAT体系和基础培养基相容的化学成分限定补充剂，通常可以在选择培养阶段同时使用。不过，正式应用前仍应通过小规模平行实验确认是否影响目标细胞生长和原有选择效果，不建议完全依赖供应商或经验参数直接替代自身体系验证。

### Q4：用了成分明确的生长补充剂以后，饲养层是不是可以直接取消？

不能仅因为加入补充剂就默认饲养层一定可以取消。更合理的方法是使用同一批细胞设置“饲养层”“无饲养层”和“替代补充剂”三组平行培养，并在相同铺板密度下比较集落形成率、集落大小和后续扩增状态。如果替代补充剂能够持续得到与饲养层相当或更稳定的结果，再考虑减少饲养层制备步骤和动物来源变量。

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## 十二、总结

杂交瘤HAT筛选后出现集落稀疏、生长缓慢或者整板无细胞存活时，真正有效的排查方式不是立即更换某一种试剂，而是先根据问题出现时间判断故障发生在哪个阶段。

如果融合后24~48小时已经出现大量细胞碎片，应首先检查PEG融合条件、亲本细胞状态和操作过程；如果早期细胞仍然存在，但第5~7天以后集落逐渐减少，则应该重点检查HAT选择压力、HGPRT缺陷稳定性、铺板密度、边缘效应、饲养层以及血清和基础培养基。

整个排查过程可以概括为：

**融合后早期状态记录 → 融合效率验证 → HGPRT表型确认 → HAT培养基验证 → 铺板密度与边缘效应 → 饲养层/生长支持比较 → 血清与培养基检查 → 操作流程回溯。**

只有先排除明显的系统误差，才适合进一步讨论是否需要额外的生长支持。对于本身融合成功、HAT选择正常，但低密度集落始终扩增困难的体系，成分明确的杂交瘤生长补充剂可以作为一个额外变量进行平行验证。

因此，杂交瘤HAT筛选优化的核心并不是“找到一种万能培养基”，而是通过时间节点和对照实验逐步确认：问题究竟来自融合、选择压力、亲本细胞、培养环境，还是新融合细胞本身的低密度增殖能力。

> 本文基于公开实验经验及相关技术资料整理，用于杂交瘤细胞融合、HAT选择培养、HGPRT缺陷验证、铺板密度优化和低密度生长支持等方向的科研实验参考。文中24~48小时、5~7天、10~14天等时间范围均对应原始资料中的建议观察条件，不同骨髓瘤细胞系、B细胞来源、PEG体系、HAT配方、血清批次和培养条件均可能影响实际结果，正式实验仍需结合自身体系完成平行验证。

摘要：杂交瘤细胞融合后进入HAT选择培养，是单克隆抗体制备中决定阳性克隆能否顺利建立的关键阶段。实验中常见两类问题：一种是融合后24~48小时内大量细胞死亡、几乎看不到有效细胞团；另一种是早期仍能观察到存活细胞，但培养至第5~7天后集落逐渐稀疏甚至消失。两类现象的排查方向并不相同，前者更需要关注PEG融合操作和亲本细胞状态，后者则更多涉及HAT选择压力、HGPRT缺陷稳定性、铺板密度、饲养层、血清及培养条件。本文按照问题出现时间梳理杂交瘤HAT筛选中集落生长不良的7项排查要点，并结合对照设计和验证方法，帮助区分融合效率问题、选择体系问题和低密度生长支持不足。

杂交瘤HAT筛选后为什么集落长不好？从融合效率、HGPRT到培养体系的7项排查

杂交瘤细胞融合后进入HAT选择培养，是单克隆抗体制备中决定阳性克隆能否顺利建立的关键阶段。实验中常见两类问题：一种是融合后24~48小时内大量细胞死亡、几乎看不到有效细胞团；另一种是早期仍能观察到存活细胞，但培养至第5~7天后集落逐渐稀疏甚至消失。两类现象的排查方向并不相同，前者更需要关注PEG融合操作和亲本细胞状态，后者则更多涉及HAT选择压力、HGPRT缺陷稳定性、铺板密度、饲养层、血清……

应用科学家

测试

杂交瘤HAT筛选后集落稀疏或消失，需按时间节点排查：融合后24-48小时大量细胞碎片，重点检查PEG融合和亲本细胞状态；第5-7天集落消退，则关注HAT选择压力、HGPRT缺陷稳定性、铺板密度及饲养层质量。采用对照实验区分融合效率、选择体系及低密度生长支持不足，并通过标准化SOP减少操作偏差。

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杂交瘤HAT筛选后为什么集落长不好？从融合效率、HGPRT到培养体系的7项排查

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