文献分享--单细胞图谱描绘化疗后肝母细胞瘤的免疫细胞重塑与增强的肿瘤-成纤维细胞相互作用

作者，Evil Genius

事业编考试马上就要开始了，大家准备好了么？只要有破釜沉舟的勇气，就一定能考上。

大家最近都在OpenClaw，而对于组学分析呢，基本上也有了omicsclaw，基本上代码部分省了很多事情，我们只需要理解关键的参数部分即可，然后文字书写分析需求，写上参数即可。

不过想要构建思路，灵活运用代码，做一些个性化的分析，目前还需要人工来做，以后工作两级分化了，光会使用属于初级，有工作的必须在AI的基础上进一步提升。

今天我们分享文献

知识积累

肝母细胞瘤（HB）

定义：一种罕见的婴幼儿肝脏恶性肿瘤，发病率近三十年显著上升。

起源：被认为起源于肝脏前体细胞（肝母细胞）。

病理特征：通常在同一肿瘤内混合存在胎儿型、胚胎型和间质型三种组织学类型。

遗传驱动：主要遗传驱动因素是CTNNB1基因的变异。

免疫细胞重塑：化疗会富集CD69+ CD8+ T细胞，并使髓系细胞向免疫激活表型转变。

肿瘤细胞异质性：恶性上皮细胞呈现肝细胞样和间质样表型的混合；高度增殖的肿瘤细胞主要属于肝细胞谱系，且高表达FGFR4。

基质细胞互作：发现一群MMP11+ 癌症相关成纤维细胞，在化疗后通过FGF-FGFR4信号通路与肿瘤细胞增强交互。

治疗启示：研究揭示了免疫细胞对化疗的响应，并指出FGF-FGFR信号与化疗耐药相关，提示FGFR4阻断可能具有治疗潜力。

结果1、原发性和化疗处理样本中HB微环境的单细胞分类学

单细胞数据分析

主要分类：通过经典标记基因将细胞分为三大类：

上皮细胞（占69%）：被鉴定为恶性肿瘤细胞（基于拷贝数变异分析）。

免疫细胞（占14%）：包括T细胞、自然杀伤T细胞、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞和B细胞。

基质细胞（占10%）：包括成纤维细胞和内皮细胞。

化疗后的关键变化

肿瘤细胞减少：化疗后，上皮（肿瘤）细胞的比例平均下降了1.5倍，证实了化疗的抗肿瘤效果（在5对配对样本中，有4例呈现下降趋势）。

T细胞浸润增加：化疗后，T细胞的比例平均增加了2.4倍，表明化疗可能促进了免疫细胞的浸润（在5对配对样本中，有4例呈现增加趋势）。

肥大细胞显著增加：在所有样本及配对样本分析中，化疗后肥大细胞的比例均显著上升。

结果2、化疗后CD69+CD8+T细胞的富集

背景：基于化疗后T细胞浸润增加的现象，进一步深入分析T细胞亚群。

亚群分类：从57,739个T细胞中鉴定出11个集群，主要包括：

CD4+ Treg

CD8+ T细胞（三个主要亚群）：

• CD8+_c1_CD69+：表达组织驻留标记CD69。
• CD8_c2_Tex：表达耗竭标记LAG3。
• CD8+_c3_KLRC2：表达细胞毒性标记KLRC2和TRGC2。

NKT细胞。

化疗后CD69+ CD8+ T细胞的富集与验证

富集现象：CD69+ CD8+ T细胞在化疗后显著增加（5对配对样本中有4例比例升高）。

实验验证：通过多重免疫组化染色分析9对匹配样本，进一步证实了化疗后CD69+ CD8+ T细胞水平升高。

CD69+ CD8+ T细胞的分子特征

非耗竭/非驻留表型：不表达组织驻留标记CD39，也不表达耗竭标记PDCD1、LAG3、HAVCR2。

功能相关标记：高表达T细胞募集标记（CXCR4、CXCR6）、效应分子（IFNG、GZMK）以及IL7R（提示其具有相对初始样的特征）。

分化轨迹：RNA速率分析显示，CD69+ CD8+ T细胞位于向Tex分化的上游路径，提示其可能是一种先天样状态，具有抗肿瘤免疫潜力。

细胞功能实验验证

实验设计：通过流式细胞分选技术从肿瘤样本中分选出CD69+ CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和PD-1+ CD8+ T细胞（Tex），分别与GFP+HepG2肝癌细胞共培养，监测肿瘤细胞存活率。

实验结果：CD69+ CD8+ T细胞表现出最强的肿瘤细胞毒性效应，提示其可能是有效的抗肿瘤亚群。

化疗后T细胞的功能增强

转录动态：化疗后的CD69+ CD8+ T细胞显著上调了T细胞效应分子（GZMB、GNLY、PRF1、IFNG）和抗原呈递相关基因（HLA-DRB1、HLA-DRB5、HLA-DQA2）。

其他T细胞：Tex和NKT细胞在化疗后也表现出增强的效应功能（效应分子和HLA家族基因上调）。

耗竭标记：未发现Tex细胞中PDCD1、TIGIT等耗竭相关基因在化疗后发生显著一致性变化。

化疗可能通过两种机制在肝母细胞瘤中诱导抗肿瘤免疫反应：

富集CD69+ CD8+ 组织驻留样T细胞。

增强不同T细胞亚群的细胞毒性功能。

结果3、化疗后髓系细胞向免疫激活表型的重塑

化疗后髓系细胞亚群的比例变化

显著下降：Macro_C1QC（C1QC+巨噬细胞）在化疗后比例显著减少（5对配对样本中有4例下降）。

显著上升：cDC3（经典树突状细胞3）在化疗后比例显著增加（5对配对样本中有4例上升）。

巨噬细胞的表型与功能转变

M1/M2分型：

• Macro_C1QC、Macro_SPP1、Macro_CCL4L2偏向M2样表型（促肿瘤）。
• Macro_ISG15偏向M1样表型（抗肿瘤）。

化疗后功能变化：

• Macro_C1QC和Macro_ISG15在化疗后均上调了抗原呈递和T细胞活化相关基因。
• 基因本体论分析显示，化疗后Macro_C1QC富集了T细胞活化和抗原呈递通路，提示其向免疫刺激环境转变。
• cDC3的变化：化疗后cDC3上调了T细胞活化和干扰素-γ应答通路相关基因，与化疗相关的有利免疫反应一致。

髓系细胞与CD69+ CD8+ T细胞的相互作用

相互作用增强：化疗后，多个髓系细胞亚群与CD69+ CD8+ T细胞之间的相互作用增强。

共刺激通路：髓系细胞（作为抗原呈递细胞）通过CD80-CD28和CD58-CD2等共刺激通路激活T细胞，这可能促进了CD69+ CD8+ T细胞的扩增。

空间转录组学验证

空间共定位：

• cDC3细胞（表达LAMP3、CCR7、CD58、CD80）与CD69+ CD8+ T细胞（表达CD2、CD28）在空间上共定位。
• 基于CD58-CD2和CD80-CD28配体-受体对的空间细胞间相互作用分析与空间邻近性一致。
• 量化分析证实CD69+ CD8+ T细胞与cDC3之间存在显著共定位。
• SPP1+巨噬细胞与CD69+ CD8+ T细胞之间通过CXCL16-CXCR6的通信也在化疗后增强，并证实其空间共定位。

结果4、识别两种主要的肿瘤细胞亚型

肿瘤细胞亚型鉴定

数据基础：对154,255个上皮细胞进行亚聚类分析，得到12个亚群。

正常细胞排除：通过计算CNV评分和Wnt信号活性，排除2个正常上皮细胞亚群（低CNV、低Wnt信号）。

转录模块：通过非负矩阵分解和差异表达基因分析，鉴定出三个转录模块：

• 模块A（间质模块）：特征基因VIM、ID3、SOX4。
• 模块B（细胞周期模块）：特征基因TOP2A、MKI67。
• 模块C（肝细胞模块）：特征基因AFP、GPC3、APOC3、APOB、FGG。

肿瘤细胞两大主要亚型

间质样细胞（MECs）：高表达间质模块基因（VIM）。包括MUC1+亚群和COL1A1+亚群。

肝细胞样细胞（HECs）：高表达肝细胞模块基因。其中部分亚群高表达肝细胞功能基因（CYP2E1、APOC3、ALB），代表更分化的状态。

中间状态：存在共表达肝细胞和间质特征的中间型细胞。

病理亚型相关性

胚胎型/混合型肿瘤：富集MECs（如MEC_C1_MUC1）。

纯胎儿型肿瘤：富集HECs。

增殖活性：循环HECs的比例在胚胎型肿瘤中最高，混合型居中，胎儿型最低。

增殖特征比较

增殖比例：循环HECs（18.0%）的增殖比例显著高于循环MECs（6.5%）。

数据验证：

• 在已发表的单细胞数据和bulk数据中均证实细胞周期模块与肝细胞模块正相关，与间质模块不相关。
• 空间转录组数据显示高增殖区域高表达AFP、低表达VIM。

化疗后变化：化疗后，循环HECs的增殖活性显著增加，而循环MECs无显著变化。

分化状态：RNA速率拟时序分析显示，循环HECs处于最低拟时序评分，代表 progenitor 状态。

基因组影响

CNV分析显示，大多数病例的肿瘤细胞具有相似的CNV水平和模式。

肿瘤细胞亚群比例与CNV评分之间关联性弱，提示表型多样性可能不完全由基因组CNV决定。

化疗后肿瘤细胞亚型的比例变化

预期 vs 实际：尽管HECs（肝细胞样细胞）增殖比例更高（理论上更易被化疗杀伤），但化疗后其比例并未显著减少；而MECs（间质样细胞）的比例则显著下降。

通路富集分析：对5例配对患者的纵向肿瘤细胞分析显示，化疗后的HECs显著上调了细胞解毒通路相关基因，而MECs中未观察到这一现象。

HECs在化疗后表现出更强的细胞解毒特征上调，这可能是其对化疗更具耐药性的原因之一。

MECs对化疗更敏感，化疗后比例显著下降。

结果5、高度增殖的HECs可能在化疗后介导肿瘤复发

肿瘤细胞亚群与化疗反应的关系

预测不良反应的亚群：增殖性HECs（HEC_C2）是最能预测化疗不良反应的肿瘤细胞亚群。无应答者在化疗后该亚群比例显著更高。

纵向变化：5例配对数据显示，3例应答者中增殖性HECs普遍减少；2例无应答者中该亚群比例增加（其中一例从11.2%升至26.9%）。

与良好反应相关的亚群：分化型HECs（HEC_C1）似乎与化疗良好反应相关。

肿瘤微环境细胞与化疗反应的关联（初步观察）

与不良反应相关（比例增加）：Tex、Tregs、C1QC+巨噬细胞/单核细胞、MMP11+ CAF。

与良好反应相关（比例增加）：CD69+ CD8+ T细胞、pDC、cDC。

说明：这些差异未达统计学显著性，可能受样本量限制。

结果6、与肿瘤细胞增殖相关的细胞间相互作用网络

运用NicheNet算法构建肿瘤细胞与肿瘤微环境其他组分之间的配体-受体网络，系统分析影响肿瘤细胞增殖的细胞间通讯。

核心发现：FGF-FGFR信号通路与肿瘤细胞增殖存在 robust 关联。

自分泌：肿瘤细胞自身高表达多种FGFs。

旁分泌：成纤维细胞高表达多种FGFs，提示成纤维细胞可通过旁分泌方式向肿瘤细胞传递FGFR信号。

FGFRs在肿瘤细胞亚型中的差异表达

表达模式：

HECs（肝细胞样细胞）：主要表达FGFR4。

MECs（间质样细胞）：主要表达FGFR1。

实验验证：通过多重免疫组化染色证实了FGFR4在AFP+ VIM- HECs中表达，FGFR1在AFP- VIM+ MECs中表达。

结果7、化疗后FGF信号由MES肿瘤细胞和MMP11+CAF增强

化疗后，间质样肿瘤细胞（MECs）和MMP11+癌症相关成纤维细胞（CAFs）共同增强了FGF-FGFR信号通路的激活。具体而言，MECs在化疗后上调了多种FGF配体的表达；而MMP11+ CAFs则高表达FGF3和FGF8，并与表达FGFR4的增殖性肝细胞样肿瘤细胞（HECs）在空间上共定位，通过FGF3-FGFR4等信号对在化疗后形成更活跃的旁分泌通讯，提示这种由MECs和特定CAFs亚群介导的FGF信号增强可能促进了HECs的增殖并参与化疗耐药。基于此，使用FGFR4抑制剂罗泊替尼在患者来源的异种移植模型（以AFP+ HECs为主）中显著抑制了肿瘤生长，减少了增殖性肿瘤细胞，且在低剂量化疗联用时表现出协同增效作用。

最后，来看看方法

空间通讯和轨迹分析

生活很好，有你更好。