文献分享（Stereo-seq）--一种保守的再上皮化程序是胰腺导管腺癌恶性转化的基础

作者，Evil Genius

假期结束，牛马上线。

无论什么时候，希望大家都保持乐观的心态，30岁以后确实和20多岁很不一样，有了家庭孩子，事业各方面都容易受挫，磕磕绊绊；生活压力也大了很多，回想工作以后，最快乐的时候就是刚参加工作的时候，住的360块一个月的房子，工资4000多，只要养活自己就行。

现在就是好好做一做，坚持一天是一天，趁着自己还有学习的劲头，往自己身上加一些技能，至于有没有用，就让命运来决定吧。

今天我们分享华大空转（Stereo-seq）的文献，通讯作者是外国人，单位是清华大学。

大家还记得之前给大家说过每个组学对基因的分类是有区别的么？大家还知道基因组是怎么划分基因的么？还有转录组的划分，希望大家心里有数,多组学的联合分析绝对是趋势。

知识积累

胰腺上皮内瘤变（PanIN）在健康个体中普遍存在，但其可进展为浸润性胰腺导管腺癌（PDAC），是PDAC最主要的癌前病变。

PDAC的恶性转化核心在于：PanIN细胞获得穿透BM、脱离导管、浸润实质组织的能力。

分子机制与动物模型

小鼠模型显示：Kras突变 + 炎症 共同诱导PanIN形成。

Kras突变“锁定”一种肿瘤样程序，来源于短暂存在的化生性祖细胞。

PanIN→PDAC进展需要肿瘤抑制基因（TSG） 的额外缺失（如Cdkn2a、Trp53）。

PDAC发生伴随显著的转录可塑性，但具体驱动恶性程序的基因尚不完全清楚。

恶性侵袭的不同模式

上皮-间充质转化（EMT）：

抑制E-钙黏蛋白，失去极性，单个间充质样细胞播散。

在小鼠PDAC模型中存在，但在人PDAC中仅约16%的晚期肿瘤出现，并非必需机制。

集体侵袭：

由整合素粘附复合物（IAC） 驱动，包括局灶粘附（FA）和侵袭小体。

半桥粒（HD）与伤口愈合程序的意外联系

1型半桥粒（HD） 通常局限于皮肤和角膜，功能是将复层上皮附着于BM。

在皮肤伤口边缘的角质形成细胞中，HD组分显著上调，并参与再上皮化过程中的细胞迁移。

伤口诱导的角质形成细胞程序包含大量与上皮迁移相关的粘附、骨架、蛋白水解、代谢基因。

结果1、与人类胰腺导管癌恶性肿瘤相关的转录程序

研究目标与方法

目标：识别与PDAC恶性程度相关的基因表达程序及其空间分布。

样本：10例未经治疗的、手术切除的原发性PDAC。

技术：Stereo-seq空间转录组学 + 非负矩阵分解（NMF）+ 稳健排序聚合（RRA）。

元程序（MP）的鉴定与分类

共鉴定出13个元程序（MP），其中大多数对应非肿瘤细胞（如内分泌细胞、腺泡细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等）。

仅MP10和MP11与肿瘤细胞相关：

MP11 → 对应经典型PDAC

MP10 → 对应基底样型PDAC（预后更差）

MP10高表达在所有PDAC队列中均强烈预示不良预后。

MP10与MP11在PanIN→PDCA进展中的动态变化

关键发现：MP10与恶性侵袭行为直接相关

基底膜突破：发生微浸润的细胞几乎总是从MP11转换为MP10。

血管浸润：参与血管浸润的癌细胞几乎全部只表达MP10，不表达MP11。

良性 vs 恶性：

MP11⁺only → 良性、结构规整的上皮

MP10⁺only → 恶性、浸润性癌细胞

结果2、在小鼠PanIN到PDAC进展过程中，MP10被激活。

小鼠模型中PanIN→PDAC的转录动态

关键转变：从PanIN到PDAC，MP11被MP10取代。

KRAS活性对MP10/11的调控

KRASG12D持续激活 → MP10高表达，MP11低表达

KRASG12D耗竭（dox撤除） → MP10下降，MP11上升（时间依赖性）

结论：MP10的维持依赖于高水平的KRAS信号。

单细胞测序揭示的罕见MP10⁺细胞

PanIN中：MP11⁺占主导（>96%），仅存在极少数（<4%）MP10⁺细胞，有时与MP11共表达。

早期浸润性PDAC（TSG缺失后）：MP10⁺细胞比例扩大至近30%。

公共数据集验证：人/小鼠PanIN→PDAC均呈现相同趋势。

PanIN中罕见的MP10⁺细胞具有“双面”特征

高表达KRASG12D （驱动癌基因信号）

同时高表达TSG：CDKN1A、CDKN2A、CDKN2B

p53依赖性基因上调

生物学意义：PanIN可自发产生少数试图“恶性转化”的细胞（激活MP10），但同时内源性TSG程序被激活，限制其进一步侵袭——这是一种内在的“刹车”机制。

结果3、TSG敲除后PanIN中表达MP10的浸润性细胞快速扩增

PanIN中天然存在罕见的MP10⁺细胞

即使在没有浸润性癌的良性PanIN中，也存在少数自发激活MP10的细胞，但这些细胞同时高表达TSG蛋白（p19ARF、p16INK4A）。

TSG缺失“释放”MP10细胞，驱动快速恶性转化

实验模型：KC; TO-Cas9（dox诱导Cas9）+ AAV-sgRNA（敲除Cdkn2a、Trp53、Smad4）

TSG缺失后MP10基因表达快速上调（3周内）

RNA-seq证实：TSG敲除后，MP10相关基因表达显著增加

IF证实：浸润细胞高表达MP10标记物（LAMC2、F3、ITGA3），同时下调MP11标记物（TFF2、LGALS4）

PanIN中天然存在一小群“潜伏”的MP10⁺细胞，它们同时被TSG程序（如Cdkn2a、Trp53）所抑制，无法扩增。只有通过TSG缺失解除这种抑制，这些细胞才能快速扩增、关闭MP11、激活MP10，并驱动从良性PanIN向浸润性PDAC的恶性转化。

刹车：TSG（Cdkn2a、Trp53等）→ 抑制MP10⁺细胞的扩增 油门：KRAS突变 → 驱动MP10激活 突破：TSG丢失 → MP10⁺细胞扩增 → 浸润性癌

结果4、核心MP10基因重现了皮肤再上皮化（CR）程序

MP10中最特异的基因并非随机分布，而是形成一个功能连贯的模块，与伤口边缘角质形成细胞迁移所需的再上皮化程序完全一致。

MP10特异性基因与皮肤再上皮化（CR）高度重叠

MP10基因在皮肤伤口愈合中被动态诱导

小鼠皮肤伤口后12-24小时，MP10基因在迁移的角质形成细胞中达到表达高峰

IF验证：F3和LAMC2在伤口边缘角质形成细胞中特异性诱导，持续至再上皮化完成

靶向CR通路的药物可抑制PDAC侵袭

mTOR抑制剂（雷帕霉素） 或 EGFR抑制剂（厄洛替尼） 处理1周

结果：Matrigel栓块周围的浸润性癌细胞数量显著减少

提示：皮肤伤口愈合所需的信号通路（mTOR、EGFR）同样驱动PDAC的侵袭行为

CR基因是PDAC恶性转化所必需的（体内基因敲除实验）

敲除单个CR基因后，其他非靶向的MP10基因表达也随之丢失 → 提示存在正反馈环路

敲除CR基因不影响 ADM形成或ADM→PanIN转变（即早期步骤不依赖CR），但阻断了PanIN→PDAC的恶性进展

MP10核心基因本质上是一个“劫持”了皮肤伤口愈合（再上皮化）程序的转录模块。这些基因（如LAMC2、ITGB4、F3）不仅是PDAC细胞脱离基底膜、浸润实质所必需的，而且它们之间通过正反馈相互维持。靶向这一程序的信号通路（mTOR、EGFR）或直接敲除CR基因，均可有效阻断PDAC的恶性侵袭。

结果5、MP10与鳞状分化及EMT截然不同

MP10 vs 鳞状分化

MP10虽然表达半桥粒等CR基因，但不伴随典型的鳞状分化程序，两者在转录调控上是解偶联的。

MP10 vs EMT

MP10的NMF中：VIM几乎不富集，CDH1和EPCAM强烈富集

单细胞数据：mPDAC中存在EMT细胞群，但MP10⁺细胞与完全EMT细胞互斥

人类PDAC中EMT极其罕见：仅占恶性细胞~0.25%，114个肿瘤中仅5个含>2% EMT细胞

IF验证：11个hPDAC中10个为CDH1⁺/VIM⁻上皮簇，仅1例出现广泛EMT

小鼠 vs 人类

尽管小鼠模型中可见一定程度的EMT，但在早期浸润和人类PDAC中，MP10是主导的、保守的侵袭驱动程序，EMT并非主要机制。

整体比较

MP10是一个谱系限制性的上皮迁移程序，与鳞状分化无关，与EMT在转录状态上互斥。在PanIN向PDAC的恶性进展中，MP10（而非EMT）是驱动基底膜突破和实质浸润的主导机制。EMT在人类PDAC中极为罕见，且通常发生于晚期肿瘤。

结果6、FOSL1——CR的驱动因子，是PDAC恶性的主调控因子

ATAC-seq

染色质重塑揭示CR与PDAC进展的共享机制

PDAC恶性进展与皮肤伤口愈合（CR）在染色质水平上高度相似。

AP-1（尤其是FOSL1）是核心转录调控因子

AP-1基序在PDAC vs PanIN和伤口愈合中均为保护程度最强的TF基序

在AP-1家族中，FOSL1是差异最大、升高最显著的成员

必需性筛选：仅有 FOSL1、JUNB、ATF4 对PDAC细胞生长/生存是必需的

谱系限制性：FOSL1在半桥粒高表达肿瘤（PDAC、SCC）中升高

预后价值：在所有AP-1成员中，高FOSL1对hPDAC不良预后预测能力最强

FOSL1/JUNB在空间上定位于侵袭前沿

FOSL1的表达受KRAS信号及CR通路药物调控

KRASG12D 耗竭 → FOSL1蛋白 ↓、MP10基因 ↓

雷帕霉素（mTOR抑制剂）或厄洛替尼（EGFR抑制剂）→ FOSL1⁺浸润性细胞 ↓

遗传学验证：FOSL1/JUNB是PDAC恶性转化的必要条件

FOSL1和JUNB是TSG缺失后恶性转化所必需的。

FOSL1单独足以驱动全胰腺恶性转化（无需TSG缺失）

FOSL1过表达不依赖TSG缺失即可驱动浸润性癌

即使在p19ARF广泛激活（TSG程序被激活）的情况下，FOSL1仍能驱动恶性表型

这一发现极为重要：FOSL1的强制表达可绕过TSG介导的肿瘤抑制屏障，直接将良性PanIN转化为浸润性癌。

结果7、FOSL1结合并激活MP10 CR基因

FOSL1过表达的表型与自然进展高度一致

FOSL1单因子足以重演PanIN→PDAC进展过程中的核心转录和表观遗传变化。

FOSL1的调控具有选择性

FOSL1并非广谱转录激活因子，而是精准调控MP10/MP11转换的关键开关。

FOSL1直接结合并调控靶基因（ChIP-seq证据）

直接靶向的CR基因示例：LAMC2、F3等恶性转化必需基因

FOSL1同时激活致癌程序和TSG程序

FOSL1-tBFP表达 → Cdkn2a mRNA ↑、p19^ARF蛋白 ↑

ChIP-seq证实：FOSL1/JUNB直接结合Cdkn2a的长距离增强子（Ncruc）

该增强子在自发性PDAC中频繁缺失（说明肿瘤通过删除此增强子来逃避FOSL1介导的TSG激活）

重要机制：FOSL1同时激活：

MP10 CR基因（驱动恶性）

Cdkn2a/TSG程序（限制恶性）

这解释了为什么在自然进展中需要额外的TSG缺失——FOSL1自带的“刹车”需要被解除才能实现完全恶性转化。

LAMC2是FOSL1驱动恶性所必需的

结论：LAMC2是FOSL1下游的关键效应分子，对于FOSL1驱动的恶性浸润是不可或缺的。

蛋白水平验证（IF）

FOSL1是直接结合并激活MP10 CR基因的主转录因子。它选择性地上调MP10程序（包括LAMC2、F3等关键侵袭基因）并抑制MP11程序，同时意外地也直接激活Cdkn2a（TSG）增强子，形成一种“双刃剑”效应：驱动恶性的同时内在地激活了限制机制。这解释了为何FOSL1单独足以启动恶性转化，但完全进展需要额外的TSG缺失。LAMC2是FOSL1下游的关键效应分子，敲除它可完全逆转FOSL1诱导的侵袭表型。

结果8、CTHRC1高表达的MP4 myCAF特异性结合恶性肿瘤细胞

肿瘤微环境影响癌细胞转录状态

成纤维细胞MP的分类与特征

CAF程序与皮肤伤口愈合的对应关系

MP4特征仅在伤口特异性成纤维细胞中表达，提示PDAC中的MP4 CAF相当于肿瘤中的“伤口相关成纤维细胞”。

不同CAF MP与肿瘤细胞的空间邻近关系

CTHRC1高表达的MP4 myCAF特异性定位在恶性MP10⁺肿瘤细胞周围，而其他CAF类型则无此特异性。

从PanIN到PDAC的CAF动态变化

随着PanIN→PDAC进展，CAF群体从MP5（iCAF）主导转向MP4（CTHRC1高myCAF）主导，与肿瘤细胞中MP10的激活和扩增在时空上同步。

蛋白水平验证（IF）

CTHRC1（而非α-SMA）的表达可预测CAF与FOSL1⁺浸润性PDAC细胞的邻近关系

在小鼠和人类PDAC中均得到验证

总结一下啊

PDAC中存在四种功能不同的成纤维细胞MP。其中，MP4（CTHRC1高表达的myCAF亚型）具有以下特征：

伤口特异性：仅在皮肤伤口愈合中的成纤维细胞中表达，提示其代表一种“伤口相关”CAF状态；

空间特异性：选择性定位在恶性MP10⁺肿瘤细胞周围，而不靠近良性MP11⁺细胞；

动态特异性：在PanIN→PDAC进展过程中数量增加，与MP10⁺恶性细胞扩增同步；

分子标记物：CTHRC1是比α-SMA更精确的恶性相关CAF标记物。

这些发现强烈提示，MP4 CAF与MP10⁺恶性肿瘤细胞之间存在功能性的相互作用，共同驱动PDAC的恶性进展。

结果9、MP4样CAF通过肿瘤细胞EGFR激活促进FOSL1表达

MP4与MP10在功能上相互依赖

MP10⁺肿瘤细胞与MP4 CAF之间存在双向互作，两者互相维持。

MP4样CAF特异性诱导PDAC细胞中FOSL1表达

是MP4 CAF的分泌因子（而非MP5 CAF）特异性上调FOSL1。

MP4 CAF状态受TGF-β信号调控

TGF-β信号维持MP4 CAF状态；KRAS突变通过上调Tgfb1间接调控CAF状态。

空间细胞通讯分析：MP4 → MP10是最强信号轴之一

基于Stereo-seq的空间邻近性 + 基因表达预测细胞间通讯

MP4-MP10相互作用被评为最强检测到的相互作用之一

MP4 CAF通过非经典配体激活肿瘤细胞EGFR

实验验证：EGFR是MP4→FOSL1信号通路的关键节点

MP4 CAF与MP10⁺ PDAC细胞之间形成一个双向互作的恶性环路：

MP4 CAF通过分泌非经典EGFR配体（CTHRC1、CCN2、VCAN等）激活肿瘤细胞EGFR信号；

EGFR激活 → 肿瘤细胞中FOSL1表达上调 → FOSL1驱动MP10 CR基因表达 → 肿瘤细胞获得侵袭能力；

同时，MP10⁺肿瘤细胞通过KRAS依赖的方式（如TGF-β）维持MP4 CAF状态；

这一互作环路解释了MP4与MP10在空间上的高度邻近性和时间上的同步扩增。

靶向EGFR（厄洛替尼）可阻断MP4 CAF对FOSL1的诱导效应，为PDAC治疗提供了理论依据。

生活很好，有你更好。