ATAC-seq实验方案2：升级版Omni-ATAC流程解读（1）-准备工作

文章来源：

Grandi FC, Modi H, Kampman L, Corces MR. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 2022 Jun;17(6):1518-1552. doi: 10.1038/s41596-022-00692-9. PMID: 35478247; PMCID: PMC9189070.

改进内容：

1.主要改进：

减少读取映射到线粒体DNA

增加各种细胞系、组织和冷冻样本的信噪比

2.细节：

细胞裂解液中添加Tween-20和digitonin来裂解多种细胞类型。NP40作为主要的渗透剂，允许细胞膜和核膜的渗透。Digitonin是一种与胆固醇和相关分子结合的皂苷，有效地渗透细胞膜，但不渗透核膜或线粒体膜。Tween-20本身是一种弱渗透剂，其主要作用是防止线粒体非特异性地与核膜结合。

Omni-ATAC在37°C的转座子反应中包括Tween-20和digitonin，以确保难于裂解的细胞类型的充分裂解。最终，向转座子反应中添加PBS，同时增加信噪比。

实验总流程

ATAC-seq文库制备包括以下步骤：

(1)原始材料的准备；

(2)Tn5转座酶插入染色质；

(3)对转座DNA进行标记和扩增文库；

(4)文库纯化与质检。

样本的准备

1.培养的细胞

新鲜培养的哺乳动物细胞，请确保细胞有较高的存活率高于90%，最好接近95%，如果细胞存活率>85%，可以用DNase预处理以除去任何游离的DNA。对于存活率较低的样本，使用Ficoll梯度法去除死细胞，或者使用荧光激活细胞分选（FACS）针对死细胞标记物，如4′,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI），碘化丙啶（PI）或Annexin V。

贴壁细胞可以用胰蛋白酶或其他适合方法从培养皿上脱离，同时保持细胞活力。悬浮细胞可以通过离心直接收集。细胞也可以冷冻保存，稍后解冻用于ATAC-seq。我们建议以约60,000个细胞（考虑到一些损失）的分装进行冷冻保存，每分装100μL的冷冻保护剂。

DNase处理细胞

为了去除高存活率培养物（85-95%存活率）中来自死细胞的游离DNA，可以用DNase处理细胞。将DNase添加到终浓度为200 Kunitz单位/mL的细胞培养基中，然后在细胞培养箱中37°C孵育30分钟。确保培养基中不含EDTA，因为DNase需要二价阳离子才能发挥作用。

每个ATAC-seq反应取65,000个细胞（假设离心和洗涤过程中有30%的细胞损失），放入1.5 mL LoBind离心管中。用无菌PBS填满离心管。在室温下以350 g离心5分钟。去除上清液，用1 mL无菌PBS重悬细胞。再次在室温下以350 g离心5分钟。得到的细胞沉淀可以作为ATAC-seq的材料。如果在PBS中未能得到清晰的细胞沉淀，可以尝试添加终浓度为0.1%（质量/体积）的Tween-20或终浓度为0.5%（质量/体积）的BSA。

2.全血

可以使用ficoll梯度法从全血中分离出外周血单个核细胞（PBMCs）。由于其独特的染色质结构和高水平的内源性蛋白酶，中性粒细胞对ATAC-seq造成影响。我们建议在进行ATAC-seq之前确保完全去除中性粒细胞，可以提高ATAC-seq数据质量。如果使用冷冻保存的PBMCs，我们建议用DNase预处理解冻的细胞，再用ficoll或FACS分选细胞。

3.组织

对于复杂组织，包括快速冷冻组织，通常建议先从组织中提取细胞核，因为直接用ATAC-seq裂解缓冲液裂解组织效率不高。研究者建立了一种细胞核提取方案，该方案对各种人类和非人类组织表现良好。当无法使用新鲜组织时，组织应在提取细胞核之前快速冷冻或存储在冷冻保护剂中。目前也有许多细胞核提取方案，某些组织类型需要专门的细胞核提取过程。文章中列出了可以考虑作为替代方案的各种细胞核提取方案与参考文献。

4.冷冻保存细胞

如果冷冻保存细胞，确保细胞在冷冻保存前的活力至关重要。一般来说，ATAC-seq评估的是细胞在冷冻保存时的状态。解冻时，会发生一些细胞膜裂解，但如果细胞或细胞核保持在4°C，核膜和染色质将被保存。因此，我们不担心解冻过程中细胞“死亡”。为了解冻约60,000个冷冻保存的细胞/细胞核的分装，我们建议直接向100 μL的冷冻保护剂中添加1 mL的冷ATAC-seq洗涤缓冲液。在冰上孵育直到冷冻保护剂解冻，然后进行第3步（对于细胞）或第8步（对于细胞核）操作。我们发现，存储在冷冻保护剂中的细胞核可以多次冻融，对下游数据质量的影响仅为非常温和。

2.材料

2.1生物材料

研究所需细胞系或起始样本

2.2试剂

• 磷酸盐缓冲液（赛默飞世尔科技，货号：10010049）
• 1mol/L Tris - 盐酸缓冲液，pH 7.5（赛默飞世尔科技，货号：15-567-027）
• 5mol/L 氯化钠溶液（康宁，货号：46-032-CV）
• 1mol/L 氯化镁溶液（英杰生命技术，货号：AM9530G）
• 无脱氧核糖核酸酶 / 核糖核酸酶超纯蒸馏水（赛默飞世尔科技，货号：10977015）
• 2% 洋地黄皂苷 质量体积比（普洛麦格，货号：G9441）

注意：洋地黄皂苷溶液具有皮肤及眼部刺激性，操作时需佩戴防护手套。

关键要点：

洋地黄皂苷粉末自行配制溶液难以精准配制，且干粉具有剧毒性。为保证实验效果，建议直接购买 2% 洋地黄皂苷成品溶液，并按照试剂配制部分说明进行稀释。

• 10% 吐温 - 20 质量体积比（默克西格玛，货号：11332465001）

关键要点：纯品吐温 - 20 稀释精度难以把控，为获得最佳实验效果，建议直接采购 10% 吐温 - 20 成品溶液。

• 10% 乙基苯基聚乙二醇替代物 质量体积比（默克西格玛，货号：11332473001）

注意：乙基苯基聚乙二醇具有皮肤及眼部刺激性，操作时需佩戴防护手套。

关键要点：纯品乙基苯基聚乙二醇替代物稀释精度难以把控，为获得最佳实验效果，建议直接采购 10% 乙基苯基聚乙二醇替代物成品溶液。

• NEBNext Ultra II Q5 2× 预混 PCR 酶（新英格兰生物实验室，货号：M0544S）

关键要点：本实验 ATAC-seq 文库构建流程已基于该款 Q5 2× 预混酶完成体系优化；可替换其他品牌 PCR 预混酶，但需重新进行实验条件优化。

• Tn5 转座酶与 DNA 片段化缓冲液试剂盒（因美纳，货号：20034197 可做 48 次反应 / 20034198 可做 96 次反应）
• DNA 纯化浓缩试剂盒 - 5（zymo 科研，货号：D4014）
• NEBNext 文库定量试剂盒（新英格兰生物实验室，货号：E7630）
• BAM Banker 细胞冻存保护剂（赛默飞世尔科技，货号：NC9582225）
• 脱氧核糖核酸酶（可选；沃辛顿生化，货号：LS002007）
• 含钙镁无酚红汉克斯平衡盐溶液（用于脱氧核糖核酸酶处理，可选；赛默飞世尔科技，货号：14025092）
• Qubit 1× 高灵敏度双链 DNA 检测试剂盒（可选；赛默飞世尔科技，货号：Q33231）

2.3 仪器设备

2μL、20μL、200μL、1000μL 单道移液器

20μL、200μL、1000μL 滤芯吸头

5mL、10mL、25mL、50mL 移液管

电动助吸器（德拉蒙德，货号：4-000-101）

1.5mL 低吸附 DNA 离心管（艾本德，货号：4043-1021）

关键要点：核酸样本需使用低吸附离心管，可减少核酸吸附管壁损耗，最大化样本回收率。

8 联无 DNase/RNase PCR 管（美国科技耗材，货号：1402-4700）

涡旋振荡器（威尔，货号：97043-562）

CFX Opus 384 实时荧光定量 PCR 仪（伯乐，货号：12011452）

C1000 Touch 基因扩增仪（伯乐，货号：1851148）

MyFuge 12 台式小型离心机（本奇马克生物科技，货号：C1012）

微型高速离心机（艾本德，货号：2231000768）

冷冻微型离心机（艾本德，货号：5404000413）

15mL、50mL 尖底离心管

1.5mL 普通微量离心管（赛默飞世尔科技，货号：14-222-155）

384 孔 PCR 板（伯乐，货号：HSP3905）

Microseal ‘B’ PCR 板封板膜（伯乐，货号：MSB1001）

MPS 1000 微孔板离心机（莱布奈特国际，货号：C1000）

恒温混匀仪（艾本德，货号：2231000680）

0.22μm 250mL 硝酸纤维素除菌滤器（康宁，货号：430756）

0.22μm 50mL PVDF 无菌离心管顶置滤器（用于脱氧核糖核酸酶处理，可选；默克西格玛，货号：SE1M179M6）

Qubit 4 荧光定量仪（可选；赛默飞世尔科技，货号：Q33238）

真空抽滤装置（可选；凯杰，货号：19413）

真空抽滤装置无菌转接接头（可选；凯杰，货号：19407）

2.4 试剂配制

1） ATAC-seq 重悬缓冲液（ATAC-RSB）

配制 100mL 体系：加入 1mL 1mol/L Tris - 盐酸（pH 7.5）、200μL 5mol/L 氯化钠、300μL 1mol/L 氯化镁，加入 98.5mL 超纯蒸馏水定容。

经 0.22μm 滤膜过滤除菌。

终浓度：10mmol/L Tris - 盐酸（pH 7.5）、10mmol/L 氯化钠、3mmol/L 氯化镁。4℃可保存 6 个月。

2）洋地黄皂苷工作液

普洛麦格原装 2% 洋地黄皂苷为二甲基亚砜溶剂体系，按体积 1:1 加入无菌水稀释，配制成 1% 质量体积比（100×）储备液。

该二甲基亚砜 - 水混合溶液在 - 20℃条件下不会结冰，-20℃分装保存，有效期 6 个月。

3）Tn5 转座酶及 2×DNA 片段化缓冲液

带接头预组装的 Tn5 转座酶（TDE1）与 2×DNA 片段化缓冲液，需采购因美纳原装试剂（见实验材料清单）。强烈建议使用原装试剂，为本实验核心反应组分。

4）NEBNext 文库定量试剂盒

按照试剂盒说明书，将引物加入酶预混液中；若需使用 ROX 染料进行荧光校正，按说明书要求添加 ROX 染料。

5）条形码接头复溶

定制条形码接头干粉，用无菌水复溶为 100μmol/L 储备液，再用无菌水稀释配制 5μmol/L 工作液。两种浓度溶液均可 - 20℃保存 5 年及以上。

6）脱氧核糖核酸酶复溶（可选）

若细胞需提前进行 DNase 处理，将冻干脱氧核糖核酸酶用汉克斯平衡盐溶液复溶，配制成 20000 Kunitz 单位 /mL 的 100× 储备液；

经 0.22μm PVDF 滤膜过滤除菌；

按实验需求分装为 100μL~1mL 每管，-20℃可保存 2 年；

冻融后的试剂可 4℃存放 1 个月，禁止反复冻融

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