空间TCR文献分享--单细胞TCR映射揭示了头颈癌中空间协调的T细胞状态

作者，Evil Genius

生活到处都是坑，越来越觉得，结婚真的是沉重的负担，如果所在城市没有房子，给孩子上的户口居然是集体户（我在太原），怪不得都不想结婚了，根本没办法结婚。

我现在都怀疑自己，跟人家姑娘结婚，是不是把媳妇和孩子都给坑了，先天就落后于人，瞬间觉得努力根本没啥意义。

看来结婚是有钱人的游戏。

今天我们分享文献，空间TCR，xenium的探针设计。

知识积累

肿瘤中存在肿瘤特异性T细胞（尤其在HPV阳性患者中），但其浸润与治疗成功之间的脱节表明，对有效抗肿瘤免疫的驱动因素仍缺乏理解。

现有矛盾与知识空白：

CD8+ T细胞虽是免疫检查点阻断（ICB）的靶点，但其存在与标准治疗后的良好预后相关，却与ICB应答无一致关联。

新证据表明，T细胞在肿瘤微环境（TME）中的空间组织是决定免疫治疗效果的关键。

但多数研究缺乏抗原特异性信息，因为人肿瘤中有大量“旁观者”（非癌症特异性）T细胞浸润。

核心内容

肿瘤浸润淋巴细胞（TILs） 的表型和TCR库与循环T细胞显著不同，仅靠血液分析无法反映瘤内免疫的复杂性。

空间异质性：即使临床和免疫学特征相似的肿瘤，其T细胞空间结构也存在显著差异，空间组织是一个独立且关键的免疫行为层面。

表型与位置的关联：

祖细胞样和记忆样T细胞定位于免疫富集区域。

耗竭T细胞则弥散分布于整个肿瘤中。

若没有克隆分辨率，这些空间模式可能被误读为特异性差异（如旁观者 vs 肿瘤特异性克隆）。

同一T细胞克隆的多样性：

携带相同TCR的T细胞表现出显著的转录组异质性，可同时包含干性样和耗竭样状态。

它们广泛分布于整个TME中。

抗原特异性的影响：

与旁观T细胞相比，肿瘤特异性克隆具有不同的邻近细胞类型和基因表达谱。

T细胞的分化不仅取决于克隆身份，更由抗原特异性与局部微环境信号的动态相互作用决定。

结果1、流式细胞术揭示了HNSCC中细胞组分特异性及患者间免疫异质性

在14个月内，前瞻性收集了27例HNSCC患者的配对肿瘤和血液样本。

部分肿瘤用于空间转录组学，分离外周血单个核细胞（PBMC）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）并冻存。

使用31色荧光抗体对配对样本及5名健康供者的PBMC进行光谱流式细胞术分析，实现高维免疫 profiling 并分选活T细胞用于后续单细胞测序。

分析内容

免疫组成特征：

T细胞是多数肿瘤中的主要免疫细胞群，但患者间差异大，与p16状态、肿瘤部位、吸烟史、复发等临床特征无显著相关。

通过无监督聚类鉴定出9个免疫细胞群体，PBMC与TIL的免疫亚群丰度存在明显差异：

血液中富集NK细胞和B细胞。

TIL中富集髓系细胞和耗竭CD8+ T细胞，与TME支持功能失调/免疫抑制细胞的结论一致。

患者间免疫异质性（三个CD45+流式分组）：

髓系高组（myeloidhigh）：富集髓系细胞，CD45+和CD3+免疫细胞绝对数量较低。

耗竭高组（exhaustedhigh）：富集耗竭CD8+ T细胞，常见于p16阳性、吸烟者、复发肿瘤、口咽或口腔肿瘤患者。

中间组：髓系和耗竭CD8+ T细胞频率较低，CD4+ T细胞和/或非耗竭CD8+ T细胞相对增多。

T细胞亚群分析：

PBMC中富集初始T细胞；TIL中富集调节性T细胞（Treg）、耗竭CD8+ T细胞和CD8+ 记忆样细胞。

耗竭高组中Treg和耗竭CD8+ T细胞最为丰富，进一步确认了各组独特的免疫格局。

结果2、单细胞RNA测序定义了转录和克隆上不同的肿瘤浸润T细胞状态

克隆扩增与多样性：

耗竭克隆是扩增最明显的T细胞群体，克隆多样性最低。

利用“TEX相关”分析识别与耗竭T细胞共享TCR的非耗竭细胞，发现多数为分裂或效应细胞（中间耗竭状态），少数为表达TCF7的细胞（含效应记忆样和干细胞样耗竭前体TPEX）。TPEX细胞稀少且分散在记忆cluster中，未形成独立群体。

N/TCM细胞TCR多样性最高，Treg和效应记忆T细胞（TEM/TPEX）中等，分裂细胞多样性低（提示选择性进入细胞周期）。

TCR重叠分析：

最大的克隆共享出现在两个耗竭cluster之间，以及记忆样与效应cluster之间。

Treg细胞和PBMC富集的TEM细胞（非肿瘤特异性CD8 T细胞）与其他cluster的TCR重叠极少，提示它们与瘤内T细胞主要分化轨迹相对独立。

Treg细胞异质性：

Treg可细分为三个亚群（Treg1→Treg3），形成从CCR7/TCF7富集表型向高表达免疫抑制基因（CCR8, FOXP3, IL10）的连续分化轴。

伴随转录演进，克隆多样性下降，Treg2与Treg3之间高克隆重叠支持共享分化路径，而Treg1与其他亚群相似性低，提示其更具可塑性或尚未完全定型。

结果3、循环和肿瘤浸润的T细胞表现出不同的克隆性和表型景观

比较头颈鳞癌患者血液循环（PBMC）与肿瘤浸润（TIL）中T细胞的克隆结构和表型差异，并分析非常规T细胞（γδ T、MAIT细胞）的特征。

区室特异性克隆格局：

无论是患者还是健康供者，PBMC中CD8+ T细胞的克隆扩增程度均高于CD4+ T细胞，其中HNSCC患者的CD8+ T细胞多样性最低。

TIL中CD8+ T细胞的多样性同样低于CD4+ T细胞。

PBMC与TIL之间的克隆重叠有限，CD8+ T细胞重叠略高于CD4+ T细胞。耗竭高组的克隆重叠更低，提示瘤内耗竭增加与血液循环TCR库的趋异程度加大相关。

循环来源与肿瘤来源T细胞的转录差异：

血液循环中丰度高的TCR主要定位于PBMC富集cluster（Pb-enr cluster，即cluster 8），该cluster的肿瘤富集度最低。

肿瘤富集克隆上调调节、效应及耗竭相关基因（如FOXP3、GZMB、CXCL13）。

血液富集克隆高表达核糖体蛋白（RPS3、RPL14）、迁移相关基因（S1PR5）及NK样基因（FCGR3A）。

FGFBP2是血液富集克隆的强标志物，可能反映T细胞从循环向TME的浸润能力（独立于抗原特异性）。

抗原特异性分析（基于VDJdb数据库）：

识别已知微生物抗原（如EBV、甲流病毒）的TCR主要存在于PBMC富集TEM、Teff/Tex-eff、TEM/TPEX等cluster中。

EBV和甲流特异性T细胞分别定位到不同cluster并呈现不同基因表达程序，提示病原体特异性免疫印记可能导致旁观者T细胞的异质性，进而影响TME整体免疫格局。

非常规T细胞（γδ T与MAIT细胞）：

γδ T细胞：主要分布于终末耗竭、TEM/TPEX、PBMC富集TEM等cluster；表达效应/NK样转录特征（NCAM1、GZMB、KLR家族）；在血液循环中比肿瘤中更丰富；多数瘤内γδ T细胞为CD4−CD8−，但仍主要定位于CD8富集cluster。

MAIT细胞：广泛分布于所有T细胞cluster；表达典型标志物（如KLRB1/CD161），下调干性相关基因（如SELL/CD62L）；肿瘤富集度较低（可能特异性针对微生物而非肿瘤抗原）；HNSCC患者循环MAIT细胞较健康供者减少，与其他癌症研究一致。

血液循环与肿瘤浸润T细胞在克隆组成、转录表型和抗原特异性上存在显著差异；非常规T细胞亚群（γδ T、MAIT）在TME中具有独特分布和表型特征；外周血TCR谱不能完全反映瘤内T细胞状态，且病原体免疫记忆可能塑造肿瘤免疫微环境。

结果4、空间转录组学在单细胞分辨率下定义了HNSCC的细胞景观

肿瘤切片进行了Xenium空间转录组学分析。

单细胞精度识别：

能够精确识别细胞类型，如共表达CD3D/CD8A和TRAC/TRBC2的CD8+ αβ T细胞。

效应潜能标志：GZMA/GZMB；耗竭表型标志：ENTPD1、HAVCR2、TOX。

可观察到抑制性受体-配体对（如TIGIT与PVR）的潜在免疫调控互作。

可区分Treg细胞（FOXP3+IL2RA+）和记忆/干细胞样T细胞（TCF7、CCR7、IL7R）。

细胞聚类与组成：

通过UMAP和聚类分析鉴定出10个不同的基因表达cluster，包括：T细胞、B细胞、髓系细胞、内皮细胞、成纤维细胞、粒细胞以及四个上皮亚群（两种恶性/肿瘤上皮，两种正常上皮）。

所有cluster在每位患者中均存在，但相对比例各异，反映了患者间TME组成的异质性。

9/10的患者以肿瘤cluster细胞为主；患者1（合并慢性淋巴细胞白血病）表现为高比例B细胞、极低上皮细胞的不典型特征。

cluster组成与其他临床因素无明确相关性。

HPV+肿瘤验证：

使用定制Xenium探针靶向HPV16基因产物，在HPV+肿瘤中可选择性表达，有效鉴定肿瘤细胞。

验证与准确性：

将基因表达cluster叠加到组织图像上，确认谱系定义转录本定位于相应细胞。

谱系特异性标志物相对局限于对应细胞类型，支持在复杂HNSCC TME中细胞类型分类和细胞分割的准确性。

结果5、细胞类型在HNSCC肿瘤微环境(TME)中表现出不同的空间相互作用。

不同细胞类型的空间邻域特征：

内皮细胞和肿瘤细胞：最常与自身同类细胞相邻，分别形成血管区和上皮区。

成纤维细胞：几乎与所有细胞类型相邻，也彼此相邻，形成广泛分布于整个肿瘤的成纤维细胞富集区。

T细胞和髓系细胞：相较于其他免疫或基质细胞，更接近肿瘤细胞，提示它们优先定位于恶性区域，而非外周或血管区域。

B细胞：主要彼此相邻，与肿瘤细胞接触有限。

细胞间通讯预测（CellChat分析）：

T细胞与髓系细胞之间预测的相互作用最强，凸显了它们在TME通讯中的核心地位。

关键通路包括：肿瘤与T细胞之间的PVR-TIGIT（免疫抑制信号）、髓系向T细胞的CD86介导信号（共刺激轴）。

T细胞转录状态与空间位置的关联：

靠近肿瘤细胞和髓系细胞的T细胞：高表达耗竭相关基因（ENTPD1、HAVCR2、LAG3、PDCD1）、效应分子（GZMA、GZMB）和活化标志物（HLA-DRA、SLAMF1），提示在肿瘤抗原刺激下被激活。

靠近正常上皮细胞的T细胞：相比邻近恶性上皮细胞的T细胞，耗竭标志物表达降低，但仍表达组织驻留记忆标志物（CD69、ITGAE/CD103）。

远离肿瘤/髓系细胞、靠近B细胞/内皮细胞/其他T细胞的T细胞：富集初始和记忆相关转录本（IL7R、SELL、CCR7、GZMK）。

靠近成纤维细胞、内皮细胞和髓系细胞的T细胞：调节性标志物（FOXP3、IL2RA）表达最高。

结论：

HNSCC肿瘤微环境中，T细胞占据多样化的空间背景：

肿瘤/髓系细胞附近：呈现激活和耗竭特征；

成纤维/内皮/髓系细胞附近：呈现调节性特征；

B细胞/内皮/成纤维/其他T细胞富集区域：呈现更初始或记忆样特征。

这表明T细胞的功能状态与其微环境空间位置密切相关。

结果6、scRNA-seq与Xenium的整合优化了空间分辨T细胞的表型分类

Xenium空间转录组学的基因覆盖范围有限，难以精确分类T细胞亚群。为此，利用患者匹配的scRNA-seq T细胞图谱，通过随机森林分类器将scRNA-seq中的T细胞亚群标签迁移到Xenium数据中，从而实现空间T细胞的表型精细分类。

主要方法与验证：

分类器基于两个数据集共有的基因进行训练，排除了分裂细胞和低转录细胞（这些状态可能是暂时的，且难以与技术变异区分）。

预测得到的RNA-seq cluster标签（RNApred）被赋予每个Xenium T细胞。

模型在保留的scRNA-seq数据上评估，总体准确率为75.6%。

主要发现：

空间T细胞组成：

各样本中，Xenium检测到的T细胞主要为终末耗竭T细胞（TEX-term）、效应记忆/干性样耗竭前体T细胞（TEM/TPEX）和调节性T细胞（Treg）。

CD8+ T细胞以TEX-term和TEM/TPEX为主；CD4+ T细胞中近半数为Treg细胞。

RNA pred cluster的Xenium基因表达谱重现了scRNA-seq中的关键转录特征（如TEX-term高表达HAVCR2、TOX；TEM/TPEX高表达GZMK；Treg表达FOXP3、IL1R2；N/TCM表达CCR7、IL7R、SELL）。

跨平台一致性：

流式细胞术定义的髓系高组中，Xenium也显示CD8+ T细胞含量及耗竭比例降低，验证了跨平台结果一致。

T细胞表型的空间分布：

典型患者（患者17）中，TEX-term细胞嵌入肿瘤密集区，而N/TCM、TEM/TPEX和Treg细胞富集于T细胞丰富区域。

距离计算证实：TEX-term细胞更倾向于靠近肿瘤细胞，而N/TCM、Treg和TEM/TPEX细胞则相对远离。

肿瘤微环境空间异质性的影响：

上述空间模式并非在所有患者中均成立：

免疫排斥型肿瘤（患者13）未见此相关性。

在肿瘤与T细胞比例高的患者中，几乎所有T细胞天然接近肿瘤细胞，空间关系分析缺乏动态范围。

这些发现强调了：看似在流式或scRNA-seq中相似的患者样本，其空间组织可能高度不同，空间背景能够揭示传统单细胞分析无法捕捉的生物学变异。

结果7、空间聚类识别出具有不同T细胞表型的有序免疫微环境

免疫细胞的空间自相关性（Moran's I分析）：

免疫细胞整体呈现显著的空间聚集，与随机分布相比有显著差异。

在T细胞亚群中，CD4+ T细胞（而非CD8+ T细胞）表现出比随机分布更强的自相关性。

在RNApred定义的T细胞亚群中，Treg细胞和TEM/TPEX细胞的自我聚集性最强。这些趋势在不同患者中相对保守。

无监督密度聚类（DBSCAN）识别免疫聚集区：

DBSCAN成功识别出高免疫细胞密度区域。典型患者（患者17）中，大多数DBSCAN聚集区主要由T细胞和髓系细胞组成，T细胞优先位于聚集区内，而髓系细胞更多分散在聚集区外。

在CD45+聚集区中，CD4+ T细胞数量超过CD8+ T细胞；TEM/TPEX、Treg和TEX-term细胞在聚集区中富集。

不同患者的CD45+ DBSCAN聚集区数量各异，与总免疫浸润量和临床特征无关，反映了免疫组织的空间异质性。

跨患者保守的聚集模式：

尽管患者间存在差异，但整体队列中出现了保守的聚集模式：CD45+生态位持续富集T细胞和髓系细胞，包括CD4+ T细胞丰度高于CD8+ T细胞，以及TEX-term、Treg和TEM/TPEX亚群的优先定位。

不同T细胞状态标志物的空间分布差异：

初始/干性样标志物（CCR7、IL7R、SELL、TCF7）、记忆相关标志物（GZMK）和调节性标志物（FOXP3）主要位于CD45+ DBSCAN聚集区内。

效应和耗竭标志物（HAVCR2、ENTPD1、GZMA、GZMB）则更常见于聚集区外。

T细胞密度区域的特征基因富集：

高T细胞密度区域：富集初始/淋巴谱系相关基因（CCR7、CD79A）以及T细胞中的初始/记忆样基因（CCR7、SELL），反映淋巴样生态位。

低T细胞密度区域：富集肿瘤相关基因（MALL、SOX2）以及T细胞中的耗竭/驻留相关基因（HAVCR2、CD101、ITGAE），以肿瘤细胞为主。

总结一下

耗竭T细胞（TEX） 主要分散分布于肿瘤密集区。

非耗竭T细胞亚群（初始/干性样、记忆样、调节性）则集中分布于免疫密集区（免疫生态位）。

这些空间组织模式在不同患者中相对保守，揭示了TME中T细胞功能状态与空间位置之间的系统性能关联。

结果8、空间映射在单细胞分辨率下解析肿瘤浸润T细胞克隆个体

为了直接在原位评估克隆身份，研究者开发了一种策略：针对每位患者，设计定制的、患者特异性的TCR靶向探针（针对肿瘤浸润丰度较高的TCR可变区），在Xenium空间转录组学平台上实现单细胞分辨率下对单个T细胞克隆的空间定位。

技术验证：

每次Xenium实验包含至少三位不同患者的TCR探针，使得不匹配的样本-探针组合可作为内部阴性对照。

大多数探针仅在对应患者的组织T细胞中被特异性检测到，而在错配样本中无信号，证实了患者特异性和细胞类型特异性。

成功验证了61个探针，在8位患者的2000多个T细胞中检测到目标克隆。

scRNA-seq与Xenium中检测到的TCR频率呈中等程度相关。

检测效率与探针的GC含量和熔解温度无关。

在7例重复测定的样本中，6例在两个独立Xenium运行中均成功检测到TCR探针，且探针重叠显著，证明方法具有良好的可重复性。变异主要来源于不同切片区域的组织含量和克隆代表性差异。

结果9、T细胞克隆的映射揭示了空间协调的功能状态

将单个T细胞克隆的空间分布与功能状态直接关联，探究克隆身份如何影响T细胞在肿瘤微环境中的空间组织和功能状态。

克隆的总体分布特征：

检测到6个肿瘤富集的TCR克隆，每个克隆均广泛分布于整个组织。

所有克隆均倾向于定位于CD45+ DBSCAN免疫聚集区内，且主要由终末耗竭T细胞（TEX-term）表型组成。

约10%的CD8+ T细胞被预测为Treg表型，这可能反映了分类器75.6%的准确率以及耗竭T细胞与Treg细胞在有限基因面板下的转录重叠（如均表达PDCD1、CTLA4、TIGIT等）。

同一克隆内的表型与空间异质性（以最丰富的CD8克隆1为例）：

同一个克隆中，RNApred定义的不同亚群以及表达干性样/耗竭基因的细胞在空间上明显分离。

更具可塑性的状态（如表达CCR7的细胞）富集于CD45+免疫聚集区内；耗竭状态（如表达GZMB的细胞）则更分散。

关键实例：克隆1的两个邻近细胞——一个表达GZMB（位于免疫聚集区外，被肿瘤细胞包围），另一个表达CCR7（位于免疫聚集区内，邻近髓系细胞和成纤维细胞）。这直接证明了：共享同一TCR的细胞可以采取不同的表型并占据不同的组织微环境。

克隆间的空间差异：

不同克隆在邻近细胞类型上存在差异：

CD4克隆（克隆4）：更常邻近成纤维细胞。

CD8克隆（克隆3）：更常邻近肿瘤细胞（邻居富集NFE2L2、MALL）。

CD8克隆（克隆14）：更常邻近其他T细胞（邻居富集CD3E、CD8A）。

基因表达与肿瘤距离的相关性也因克隆而异：

克隆1、3、10：靠近肿瘤细胞时，耗竭标志物表达增加。

CD4克隆：靠近肿瘤细胞时，FOXP3表达增加。

单个T细胞克隆内部存在显著的功能和空间多样性。

同一克隆的T细胞可以在不同微环境背景下分化为不同状态（可塑性/干性样 vs 耗竭），而非克隆身份单一决定命运。

结果10、T细胞克隆在患者间显著不同，包括聚类、表型和肿瘤富集

比较两位临床特征相似（均为p16阳性、吸烟者、原发肿瘤、流式定义的耗竭高组）但空间免疫组织截然不同的患者（患者12：存在大的免疫生态位；患者9：免疫细胞弥散分布），探究T细胞克隆的空间分布、表型和肿瘤富集程度的差异。

T细胞克隆的空间分布、转录状态和肿瘤富集程度在不同患者间存在显著差异，定义了异质性的瘤内T细胞克隆结构。

这些差异无法仅通过流式细胞术、单细胞RNA测序或临床变量完全捕捉，凸显了空间分析在解析肿瘤免疫复杂性中的独特价值。

大的免疫生态位可能为干细胞样/可塑性T细胞（TEM/TPEX）提供支持性微环境，而弥散分布的患者则以终末耗竭T细胞为主。

生活很好，有你更好