ATAC-seq实验方案3：升级版Omni-ATAC流程解读（2）-实验过程

Transposition (Timing: 2.5h for ~12 samples)

1.收集50,000个新鲜培养的细胞，放在1.5 mL的LoBind 管中（管壁不容易结合DNA或者蛋白质的EP管）。

2. 在开始之前，准备ATAC-seq裂解缓冲液和ATAC-seq洗涤缓冲液，并将其放在冰上。确保每次使用新鲜制备的ATAC-seq裂解缓冲液和ATAC-seq洗涤缓冲液。

3.在固定角度微量离心机中以500 g的速度在4°C下离心5分钟。将离心管子以一致的方式放置，以便沉淀在管底，并可从外表面观察到。

4.使用两次移液步骤吸取所有上清液。首先，使用p1000移液器吸取至100 μL。然后，使用p200移液器去除最后的100 μL。关键步骤：在移液时确保避免碰触可见的细胞沉淀。通过一致和流畅的动作去除最后100 μL，可以有效地去除上清液并最小化减少对细胞沉淀的破坏，避免中断实验。

5.将细胞沉淀重悬于50 μL的ATAC-seq裂解缓冲液中，来回吹打三次。

ATAC-seq裂解缓冲液

6.在冰上孵育3分钟。如果需要裂解多个样本，确保所有样本都裂解相同的总时间，在3分钟后继续进行第7步。

7. 向管中加入1 mL的ATAC-seq洗涤缓冲液以稀释裂解试剂。将管子反转5次混匀。

ATAC-seq洗涤缓冲液

8.在固定角度微量离心机中以500 g的速度在4°C下离心细胞核10分钟。将管子以一致的方式放置，以确保沉淀最终位于相同的位置。如果使用从冷冻组织中分离的细胞核，请从此步骤开始ATAC-seq实验，使用50,000个细胞核重悬于1 mL的ATAC-seq洗涤缓冲液中。

9.丢弃上清液。首先，使用p1000移液器吸取至100 μL。然后，使用p200移液器去除最后的100 μL。

关键步骤：在移液时确保避免碰触可见的细胞沉淀。通过一致和流畅的动作去除最后100 μL，可以有效地去除上清液并最小化减少对细胞沉淀的破坏，避免中断实验。。

10.将细胞沉淀重悬于50 μL的Tn5反应液中，使用移液器上下吹打6次。Tn5反应液应每次新鲜制备，并在使用前充分混合。

Tn5反应液

11. 在37°C下使用热混合器（1000 RPM混合）孵育反应30分钟。

12. 从热混合器中取出管子，立即通过加入250 μL（5倍体积）的DNA结合缓冲液（来自DNA Clean and Concentrator-5 Kit）终止转位反应，并通过移液或反转充分混匀。(解读：直接用ＰＣＲ纯化试剂盒中溶液进行ＤＮＡ纯化或者DNA磁珠进行DNA纯化富集）

关键步骤：我们强烈建议使用不同的试剂盒/试剂来清理扩增前后的产物，以避免扩增后的产物污染扩增前的样本。

13.短暂离心，将溶液收集到管底。 暂停点：该溶液可在−20°C下保存最多2周。在继续操作前，将此混合物回温至室温（22°C）并彻底混匀。

14.使用DNA Clean and Concentrator-5 Kit清理转位反应。如果使用真空流路，我们建议使用无菌一次性VacConnectors，以防止交叉污染。将每个样本（与DNA结合缓冲液混合）转移到Zymo-Spin柱中，放入收集管中。以10,000 g的速度在室温下离心30秒，弃去流出液。

15.向柱中加入200 μL的DNA洗涤缓冲液，并以10,000 g的速度在室温下离心30秒。

16.重复此洗涤步骤，总共进行2次洗涤。

17.在第二次洗涤后进行最终的“干离心”，以去除柱膜上的残余洗涤缓冲液。为此，移除收集管中的流出液，并在室温下以>13,000 g的速度离心1分钟。

18.将柱子转移到一个干净的、预标记的1.5 mL LoBind管中。将21 μL的洗脱缓冲液直接加到柱膜上，静置1分钟。

19.在室温下以13,000 g的速度离心1分钟，以洗脱DNA。此洗脱体积通常会得到约20 μL的产物。

暂停点：此溶液可在−20°C下保存，保存时间不限。

Barcoding of transposed fragments (Timing: 30m)

20.将实验中的每个样本分配到补充表2中列出的Adapter 1和Adapter 2序列的唯一组合，并记录此信息。这些组合将用于将每个读对分配到其相应的样本标识（解读：就是分配每一个样本的P5，P7测序建库indx引物）。 关键步骤：接头包含了双重索引样本特异性条形码；因此，每个样本应该分配一个唯一的Adapter 1和Adapter 2组合。更明确地说，如果两个不同的样本共享相同的Adapter 1，只要它们可以通过Adapter 2区分，就可以；反之亦然。具有相同Adapter 1和Adapter 2组合的样本不能一起测序，因为来自每个样本的索引读取将无法区分。

21.将每个清理后的转位DNA样本转移到200 μL的PCR管中。

22.向每个管中加入25 μL的NEBNext Ultra II Q5 2x Master Mix。

23.向每个样本中加入2.5 μL相应的Adapter 1。

24.向每个样本中加入2.5 μL相应的Adapter 2。

25.盖上管盖，涡旋混匀并离心以将所有液体集中到管底。完成后，每个反应应包含以下成分：

Barcoding PCR Reaction (per sample)

26 .Run the barcoding PCR reactions according to the following cycling conditions:

关键步骤：在72°C下的初始5分钟孵育对扩增反应的成功至关重要。这是因为：（i）转座的DNA包含缺口和悬垂链，在变性之前必须填充这些缺口

27.从热循环仪中取出管子并将其存放在冰上。立即进行下一步。 关键步骤：扩增的额外循环将在这个反应管中直接进行，并使用相同的试剂，因此保持样本冷却并立即进行下一步非常重要。

Library quantification and amplification (Timing: 3h)

28. 确定如何定量文库浓度。步骤29-32详细描述了使用NEBNext文库定量试剂盒的优化定量方法，还可以根据制造商的建议使用其他类似产品。当准备非常少的ATAC-seq文库（少于4个）时，使用Qubit荧光计（Invitrogen）进行的替代定量方法可能会更快，但精确度较低 (解读：一般实验室就用Qubit方法即可）。

29. 通过将10x NEB稀释缓冲液在水中稀释（每个样本约100 μL）来制备足够体积的1x NEB稀释缓冲液。

30.将1 μL的预扩增样本与99 μL的1x NEB稀释缓冲液稀释，形成1:100的稀释，并充分混匀。

31.使用NEBNext文库定量试剂盒在384孔板中制备10 μL的qPCR反应。以技术重复的方式运行所有样本、4个标准和一个无模板对照。

Library Quantification qPCR Mix

32.密封板，使用涡旋混匀，短暂离心以将样本集中到每个孔的底部，然后按照以下循环条件运行：

33.完成qPCR后，使用标准曲线确定预扩增样本中DNA的浓度。我们发现不需要根据平均文库片段大小调整结果浓度。使用约50,000个细胞作为输入时，典型的文库浓度通常在0.7 nM至2 nM之间。然而，浓度将取决于许多因素，包括输入细胞/细胞核的数量、活力以及在处理过程中丢失的细胞/细胞核比例。

34.使用前一步获得的浓度估算需要多少额外的循环才能在柱子清理后获得最终产量240 fmoles（20 μL，12 nM）。此PCR反应非常高效，因此我们假设每个循环浓度会完美地翻倍。

35.将包含预扩增反应的管子（现在包含49 μL）放回热循环仪中，无需添加任何试剂，运行每个样本所需的额外循环数。

PAUSE POINT: Amplified libraries can be stored at −20 °C overnight.

35.将PCR管从热循环仪中取出，并将49 μL的扩增样本转移到一个干净的预标记1.5 mL LoBind管中。

文库纯化（step36-42）

36. 向每个管中加入245 μL的DNA结合缓冲液（来自Zymo DNA Clean and Concentrator-5试剂盒），并通过移液混合均匀。

关键步骤：我们强烈建议使用不同的试剂盒/试剂来清理预扩增和后扩增产品，以避免将后扩增产品交叉污染到预扩增样本中。

37.将每个与DNA结合缓冲液混合的样本转移到Zymo-Spin柱中，并放入收集管中。在室温下以10,000 g离心30秒，弃去流出液。

38.向柱中加入200 μL的DNA洗涤缓冲液，并在室温下以10,000 g离心30秒。

39.重复此洗涤步骤，总共进行2次洗涤。

40.在第二次洗涤后进行最终的“干离心”，以去除柱膜上残留的洗涤缓冲液痕迹。为此，去除收集管中的任何流出液，并在室温下以>13,000 g离心柱和收集管1分钟。

41.将柱子转移到一个干净的预标记1.5 mL LoBind管中。将21 μL的洗脱缓冲液直接加到柱膜上，静置1分钟。

42.在室温下以13,000 g离心柱1分钟以洗脱DNA。此洗脱体积通常会产生20 μL的产物。

暂停点：该溶液可以在−20 °C下存储，直至需要。

Final library concentration determination (Timing: 2h)

关键步骤：在这里，我们描述了通过qPCR进行的最终文库定量，我们发现这是确定ATAC-seq文库浓度最可靠的方法。或者，也可以使用Qubit来获得估计的文库浓度，以便对样本进行合并。

43.通过将10x NEB稀释缓冲液在水中稀释（每个样本约220 μL）来制备足够体积的1x NEB稀释缓冲液。

44.将步骤43中的样本稀释4000倍，使其浓度范围落在标准品的范围内（0.01 pM至10 pM）。为此，首先通过将0.5 μL文库加入19.5 μL的1x NEB稀释缓冲液，进行40倍稀释。混合均匀后，再将2 μL这种40倍稀释的混合液加入198 μL的1x NEB稀释缓冲液，进行100倍稀释，从而得到总共4000倍的稀释。

故障排除

45.使用NEBNext文库定量试剂盒在384孔板中制备10 μL的qPCR反应。以技术重复的方式运行所有稀释后的样本、4个标准和一个无模板对照（少量样本就用8排管）

Library Quantification qPCR Mix

46.密封板，使用涡旋混匀，短暂离心以将样本集中到每个孔的底部，然后按照以下循环条件运行：

47. 完成qPCR后，使用标准曲线确定每个最终ATAC-seq文库中DNA的浓度。

48.样本现在已准备好进行高通量测序。质量评估后，文库应送去进行高通量测序。