正刊分享（CODEX）--利用单细胞转录组学和蛋白质组成像技术绘制人类骨髓微环境的细胞生物地理图谱

作者，Evil Genius

其实所谓的生信培训，并没有什么新鲜的东西，就是以下几点：

1、总结文献思路

2、汇总分析特点 + 具体案例。

3、代码实现。

没有什么特别的，跟做科研一样的，参考一篇文章，那叫抄袭，参考10篇，那叫总结，参考100篇，那叫创新，培训也是一样的，如果讲师看了几十篇文章然后总结出来的内容，自然更具代表性，对参数的理解、案例的解析、思路的总结自然会更深刻一点，后面深入理解了之后，代码来实现即可。

比如分析CN的距离选择，我怎么知道的？还不是看了几十篇文章发现选择的规律，总结出来的。

我个人的态度就是，看文献这都是基本功，看得多了，自然心里就知道该怎么做了，自己平时多做做，多总结，多实操数据，完全不需要参加培训，只不过这是一个长期积累的过程，能不能耐住性子，看大家自己了。

当然了，有人带能节省很大的精力和时间，就像我参加工作一样，如果一个人盲目摸索，没有领导带我的话，光学习代码估计就需要很长时间；但是大家也要明白，有人带我们总是一时的，能不能保持自我更新，自我学习的能力，还是要看自己。

不过也要说实话，生信的回报率，比起其他专业（跟我高中同学比），要低得多；生信付出10分，也就获得2-3分，其他专业付出10分，回报率怎么也到5分了，我的高中同学很多都本科毕业，因为专业的原因，现在的收入都不算低，而同等的工资收入，来到生物相关的专业，基本上都要硕士博士，而且到了中层才行。

而且很多医生，课题组的人笼统的认为生信人员什么都会，什么基因组、蛋白组、单细胞空间都会，而实际上，能精通一个组学已经相当不易了；有个同事去了医院的课题组，招聘的时候要求会分析单细胞，结果去了需要分析好几个课题，不仅单细胞、还要基因组、宏基因组等等，搞的没做几天就跑了。

今天我们分享文献

通讯是一位大牛。

知识积累

骨髓是一个复杂的器官，包含造血细胞及间充质、内皮、血管平滑肌和神经等多种谱系细胞。

非造血细胞虽然数量稀少（占骨髓细胞总数不到0.5%），但对造血功能至关重要。

结果1、人类骨髓的全面scRNA-seq图谱

样本来源：从16位接受髋关节置换术的患者（52-80岁）的股骨头中获取新鲜骨髓组织。

测序与数据：对12个样本进行scRNA-seq（共测得53,417个造血细胞和29,325个非造血细胞），另外12个样本用于CODEX空间分析，其中有8个样本重叠。每个细胞中位UMI数为16,903，中位基因数为3,117，线粒体读段比例仅3%，数据质量高。

造血细胞分析结果：

成功鉴定出三系造血细胞和HSPC亚群。

改进之处：与依赖密度梯度离心（会丢失粒细胞）的传统方法不同，本研究完整捕获了粒细胞的分化轨迹（如表达CSF3R），并因CD45去除步骤而获得了大量浆细胞（表达MZB1）。

年龄因素未明显影响捕获的细胞类型频率。

非造血细胞分析结果（重点）：

鉴定出三大细胞谱系：血管平滑肌细胞、内皮细胞和间充质细胞（包括间充质基质细胞和成骨细胞）。

关键发现：与以往认为人类MSC相对同质且偏向脂肪转录谱的研究不同，本研究通过酶解法释放的细胞显示出高度异质性，包含多个不同的细胞亚群，揭示了骨髓中非造血细胞远比现有参考图谱更为多样。

结果2、非造血细胞亚群分析显示MSC和EC的转录多样性

间充质细胞中鉴定出多个不同亚群：

成骨谱系细胞：分为高表达IBSP/BGLAP的成骨细胞和低表达的骨祖MSC。

脂肪谱系细胞：鉴定出一类高表达CXCL12及脂肪相关基因（CEBPA、PPARG、APOE、LPL）的细胞，命名为Adipo-MSC（对应小鼠中的MALP和Adipo-CAR细胞）。

THY1+ MSC：高表达THY1和LBP，LPL表达低于Adipo-MSC，目前未发现明确的小鼠同源细胞。

成纤维样MSC（Fibro-MSC）：高表达CXCL12、DPT、NT5E、PDPN、HAS1，与小鼠早期间充质祖细胞及人类骨骼干细胞高度一致。

APOD+ MSC：高表达APOD和GSN，此前未见报道，为新发现亚群。

分化潜能：通过流式分选和CFU-F实验证实，Fibro-MSC的成纤维细胞集落形成能力最强，增殖能力也最强，且能分化为成骨、成脂和成软骨细胞，符合ISCT定义的间充质干细胞标准。THY1+ MSC次之，而Adipo-MSC和成骨相关MSC能力最弱。

标志物评估：传统MSC标志物CD90（THY1）在不同亚群中表达差异大，用它分选会产生偏倚（偏向Fibro-和THY1+ MSC）。而NGFR（CD271） 在各亚群中表达更稳定，是更理想的“无偏倚”MSC标志物。小鼠中的MSC标志物NES在人类MSC中不表达，反而表达于内皮细胞和血管平滑肌细胞。

内皮细胞分析：

鉴定出两类主要内皮细胞：动脉内皮细胞（高表达CXCL12、ICAM2）和窦状隙内皮细胞（高表达ACKR1、SELE，参与内皮-造血细胞相互作用）。未发现H型血管或典型的淋巴管内皮细胞簇。

方法学对比与图谱价值：

与已发表的穿刺来源的人类MSC数据相比，穿刺样本中Adipo-MSC占绝对主导，而本图谱捕获的非Adipo-MSC亚群数量是所有这些数据集总和的24.4倍。Fibro-MSC和THY1+ MSC在他人数据中几乎未被捕获。

与胎儿骨髓数据对比显示，成人与胎儿的MSC亚群有较好的对应关系，但成人Fibro-MSC更接近典型成纤维细胞，而胎儿Fibro-MSC具有放射状胶质细胞特征（可能提示神经嵴起源）。

结果3、间充质干细胞(MSCs)、内皮细胞(ECs)和成骨细胞样细胞协同产生多种造血支持因子

MSC亚群的功能特化：

Adipo-MSC和THY1+ MSC：高表达经典的HSC微环境因子，如CXCL12（CXCL家族）、KITLG（KIT家族）、CSF1和IL-7，在支持HSPC维持、髓系造血和淋巴系造血方面转录特化程度最高。

Fibro-MSC：主要高表达IGF1。

成骨谱系细胞：高表达TGFB1和CDH2（已知在小鼠中维持HSC静息状态），但淋巴相关因子表达水平不高。

共培养验证：将分选的MSC亚群与新鲜CD34+细胞共培养，发现Adipo-、Osteo-、THY1+ MSC（及Fibro-MSC有强烈趋势）能显著维持原始的Lin⁻ CD34⁺ CD38⁻细胞，而单独培养时这些细胞很难保存。

非MSC细胞的贡献：

窦状隙内皮细胞：通过表达E-选择素向HSC提供信号。

CD4+ T细胞：虽非典型微环境细胞，却是骨髓中FLT3LG的主要生产者，可作用于HSC、GMP和CLP，对髓系和淋巴系造血均重要。

血管微环境（内皮细胞和血管平滑肌细胞）：是骨髓中Notch信号（DLL1、DLL4、JAG1、JAG2）的主要贡献者，其中小动脉（动脉内皮细胞+血管平滑肌细胞）表达的JAG1最高。间充质细胞虽然也贡献部分Notch信号（主要靠JAG1），但强度弱于内皮驱动者。

细胞间通讯预测（CellChat分析）：

整体上，间充质谱系细胞是信号输出（作为配体）最主要的细胞类型。

通过非负矩阵分解识别出不同模块：骨内膜模块（富含NGF、ncWNT、骨桥蛋白等骨相关家族）主要由成骨相关细胞贡献；MSC模块（富含KIT、FGF、THY1等家族）主要由CXCL12高表达的MSC（如Adipo-和THY1+ MSC）贡献；血管平滑肌细胞和小动脉内皮细胞同时参与骨内膜和血管信号模块。

有趣的是，几乎所有非造血细胞类型及HSPC自身都在一定程度上接收Notch信号，提示微环境各元素之间存在串扰和协同调控。

结果4、CODEX多重成像揭示了人体骨髓微环境的原位解剖结构

基于scRNA-seq数据设计并验证了54重抗体组合（53种抗体 + DAPI）。特别加入了来自scRNA-seq的标志物（如SPINK2，用于高分辨率识别原始HSPC，因为CODEX的动态范围低于流式细胞术）。

共计算注释了803,132个细胞（占分割物体的91.6%），覆盖12个样本中的32种细胞类型，包括罕见的免疫表型HSC（Lin⁻ CD34⁺ CD38⁻ CD45RA⁻ CD90⁺）和施万细胞（PLP1⁺ CD271⁺）。

个体间细胞类型分布相似，蛋白水平表型验证了如所有巨噬细胞均CD163阳性、GATA1⁺巨核细胞存在不同亚群等有趣模式。

非造血细胞的空间定位关键发现：

成功识别了动脉内皮细胞、窦状隙内皮细胞、血管平滑肌细胞、骨内膜细胞、Adipo-MSC和THY1+ MSC。

Osteo-MSC和Fibro-MSC在计算聚类中未能自动检测到，推测这些细胞与骨组织结合紧密，在样本处理过程中容易丢失。通过手动仔细检查，确实发现了少量此类细胞：

• Osteo-MSC和成骨细胞位于造血组织-骨组织交界面上。
• Podoplanin+ Fibro-MSC主要位于骨区域的中部。

手动注释的422个Osteo-MSC中，53%与骨内膜细胞聚类重叠，表明骨内膜细胞群体富含成骨谱系细胞。

结果5、EMP和GMP定位在相对高氧的动脉-骨内膜微环境中

空间微环境分析（基于CODEX）

通过无监督邻域分析，在骨髓中识别出15个细胞邻域（CN）。

这里注意CN的注释， performed unsupervised neighborhood analysis as previously described and identified 15 CNs that we manu ally annotated based on their enrichment of cell types using hypergeometric tests。

两个邻域（CN4和CN6） 富集了GMP/髓母细胞和EMP，它们强烈定位于骨内膜表面以及小动脉周围。分别命名为“早期髓系/小动脉”（CN4）和“早期髓系/骨内膜”（CN6）。

小动脉细胞出现在骨小梁附近的频率显著高于随机预期，提示骨内膜微环境与小动脉微环境可能是协同而非独立的。

HSPC（包括更原始的SPINK2+ HSPC）主要存在于混合谱系邻域中，并不优先占据骨内膜或小动脉周围微环境（支持近期的研究结论）。

缺氧状态分析：“相对高氧”微环境

在CODEX数据中，EMP和GMP的HIF1A水平很低，表明这些细胞并未处于缺氧状态，这与它们定位于靠近供氧血管相符。而更成熟的髓系细胞HIF1A水平则较高。

位于非小动脉邻域中的EMP，其HIF1A水平更高，说明缺氧的空间模式并非由细胞内在差异导致。

在scRNA-seq数据中，EMP的缺氧特征评分也是所有细胞中最低的，进一步支持了CODEX的发现。

结论：尽管骨髓整体上是缺氧环境，但早期髓系造血发生在一个相对高氧的微环境中。

多组学数据整合与验证

CODEX验证RNA/通讯预测：设计了针对配体-受体对的额外CODEX抗体组合，验证了多项预测：CXCL12区分小动脉内皮与窦内皮；Notch配体（JAG1、DLL4）存在于血管平滑肌细胞和小动脉内皮（其中血管平滑肌细胞表达DLL4是首次发现但已有报道）；FGF2表达于小动脉内皮；Angiopoietin-1表达于MSC突起。

空间邻近性与通讯强度的关联：受体的表达水平与靶细胞的空间邻近程度呈剂量依赖性。CellChat预测的相互作用能够被空间邻近关系所复现。

创新指标CCES：开发了统一的CellChat-CODEX效应量评分，用于衡量特定细胞类型对是否同时具有“空间共定位”和“高预测通讯权重”。成骨细胞-血管平滑肌细胞是该指标评分最高的相互作用之一，它们共定位并构成了与低缺氧特征相关的“小动脉-骨内膜微环境”。小动脉被Ⅰ型胶原包裹（成骨细胞中表达最高），为该结构关系提供了可能的机制解释。

结果6、基于成像的显微解剖结构分析揭示了HSPCs在脂肪细胞周围的位置

利用CODEX成像数据进行微解剖结构分析，研究了脂肪细胞、小动脉、骨、巨噬细胞、血窦和CXCL12+基质等复杂结构的空间分布，并揭示了HSPC与脂肪细胞的特殊空间关系。

研究目标： 分析那些因形状复杂或体积较大而无法通过常规细胞分割方法准确捕获的微环境结构（如脂肪细胞、小动脉、骨、巨噬细胞突起、血窦、CXCL12+基质）的空间分布特征。

采用人工标注和阈值法对这些结构进行标注，然后利用点模式分析计算各类细胞或邻域到这些结构的距离，并通过置换检验评估显著性。

分析验证了细胞类型与预期结构的共定位，如：Adipo-MSC与CXCL12+基质、巨噬细胞与自身、骨内膜细胞与骨、窦内皮与血窦。

关键空间发现：

小动脉-骨紧密关联：在所有测量结构中，小动脉距离骨最近（p=4.2e-6），证实了骨内膜微环境富集小动脉的结论。由血窦、脂肪细胞、基质和巨噬细胞定义的中心区域则距离骨较远。

HSPC特异性地靠近脂肪细胞：

• Lin⁻ SPINK2⁺ HSPC和SPINK2⁻ CD34⁺ HSPC（均为早期HSPC）靠近脂肪细胞的程度均显著高于随机预期。
• CODEX图像手动检查确认两种HSPC确实与脂肪细胞有接触。
• 更原始的SPINK2⁺ HSPC并不靠近巨噬细胞（而其他HSPC靠近），提示存在功能差异。

髓系发育的空间限制模型：

早期HSPC定位于脂肪细胞微环境中。

EMP和GMP（早期髓系祖细胞）也靠近脂肪细胞，但显著更靠近骨（而HSPC不靠近骨），并定位于相对高氧的小动脉-骨内膜微环境。

成熟髓系细胞则最靠近血窦，远离小动脉和骨，提示它们在中央的血窦周围微环境中完成成熟，并可能利用血窦从骨髓向外周血迁移。

研究通过结构分析，提出了一个髓系发育的三阶段空间模型：HSPC首先驻留在脂肪细胞微环境中；早期髓系祖细胞（EMP/GMP）随后迁移到小动脉-骨内膜微环境进行分化；最终成熟细胞转移到血窦周围微环境，准备进入血液循环。其中，脂肪细胞被识别为HSPC的一个重要空间定位微环境，这一发现超越了传统的“HSPC主要存在于血管/骨内膜”的认识。

结果7、使用健康骨髓CODEX图谱进行无监督参考映射揭示了AML基质扩张和新的AML-MSC富集区域

利用健康骨髓CODEX图谱作为参考，分析AML患者样本（诊断期、治疗后）的肿瘤演化及微环境变化。

样本与方法：

分析3例诊断期AML、2例配对Venetoclax+HMA治疗后的AML患者髂骨活检样本，以及3例阴性淋巴瘤分期（NSM）对照样本（髂骨）。

选择携带NPM1突变的患者（可用突变特异性抗体），以识别白血病原始细胞。

采用RPCA参考映射方法，将患者样本中的细胞分类到健康图谱中最接近的细胞类型。

主要发现：

图谱的实用性与普遍性验证

Dx AML中髓系细胞比例显著高于NSM（47.6% vs 23.1%），证明图谱能快速注释健康和疾病状态下的细胞。

NSM样本与股骨头样本的细胞邻域组成高度相似（中位相关性R=0.71），证明确实图谱数据可推广至髂骨，且NSM可作为合理对照。NSM中也存在全部4种MSC亚群和CD34+细胞与脂肪细胞接触的现象。

AML中的显著变化

结构改变：Dx和PostTx样本中，脂肪细胞几乎完全消失；治疗后30天，残存原始细胞且造血恢复不完全。

基质扩增：与NSM相比，AML样本中Adipo-MSC和THY1+ MSCs的相对频率升高2-3倍。

邻域分析：识别出4个富集白血病原始细胞的邻域（Dx-CN3/5/9/12）。THY1+ MSC被显著富集在这些原始细胞富集的邻域中（且仅在这些邻域中）。

治疗后变化：PostTx原始细胞富集邻域（如PostTx-CN4/14）与健康的小动脉-骨内膜早期髓系微环境相似。但恢复中的GMP/EMP邻域不含小动脉内皮/骨内膜细胞，可能与稳态造血与紧急造血的差异有关。

NPM1突变原始细胞的特性

通过突变NPM1和CD141染色成功识别白血病原始细胞，包括治疗后样本中的GATA1+NPM1c+双阳性群体。治疗后原始细胞中GATA1表达升高2倍，提示谱系可塑性。

原始细胞的HIF1A水平较低（与GMP/早期髓系细胞一致）。配对比较显示，治疗后细胞的BCL2表达轻度降低、线粒体复合物IV表达增加，可能反映了对BCL2通路依赖性降低及线粒体质量代偿性增加（以抵抗Venetoclax的抑制作用）。

结论与意义：

本研究证明了健康骨髓CODEX图谱在疾病研究中的应用价值。在AML中，间充质基质细胞（尤其是THY1+ MSC）显著扩增，且白血病原始细胞定位在类似健康早期髓系的小动脉-骨内膜微环境中（该微环境同时也是健康EMP的定位区域）。这提示该微环境可能在治疗抵抗中发挥作用，为AML的微环境靶向治疗提供了新的空间视角。

最后，我们来看看方法

生活很好，有你更好。