文献分享（visium）--空间转录组学的泛癌分析揭示异质性肿瘤空间微环境

作者，Evil Genius

关于低精度的空间平台，虽然目前新课题采用的比例变少了，但是其仍然具有独特的优势，所以不会被淘汰，而且之前测了很多的visium数据，很多仍然未发文章，说明分析这部分存在一定的卡点。

我个人还是非常喜欢visium的，无论是绘图还是数据分析相对都好很多。学生时代是科研的最好时代，因为没有其他的压力，脱离了学生时代，就被生活压力给包围了。

大家还记得培训的内容么？细胞的基因表达特点依赖于其空间位置（即微环境）。

今天我们分享文献

知识积累

空间转录组学，研究人员能够解析TLS的分子特征，并证明TLS与更好的生存期及免疫治疗反应相关。

根据成纤维细胞的邻近细胞类型，可将其分为四种保守的空间亚型，这些亚型产生不同的预后影响（王凌华的研究成果）。

结果1、泛癌空间转录组学数据分析概述

构建了一个涵盖12种癌症类型（如乳腺癌、结直肠癌、肝癌、肺癌等）、373个样本、包含993,380个空间点位的泛癌空间转录组图谱。

细胞类型鉴定与组织分区：利用RCTD算法推断每个空间点位的细胞类型组成，并结合CNV（拷贝数变异）将组织划分为良性区、基质区和恶性区。结果显示，例如胰腺癌的基质区比例很高，而恶性区主要由肿瘤细胞主导。

定义局部细胞程序（LCP）：为了刻画TSME，对恶性区和基质区内的细胞组成分别进行无监督聚类，识别出：

28个恶性局部细胞程序（MLCP）

28个基质局部细胞程序（SLCP）

这些LCP的丰度在不同癌症类型间差异很大。例如，MLCP_Tumor（肿瘤细胞主导的程序）在皮肤鳞状细胞癌中比例高，在肾癌中比例低。

解析LCP的空间分布：

自身聚集性：MLCP_Tumor的自我连接度最高，反映了肿瘤细胞的局部聚集。值得注意的是，SLCP_CD4 T/B虽然数量不多，但自我连接度最高，表明其形成了高度有序的结构。

空间邻近社区：共识别出10个空间邻近社区。其中发现了两个与巨噬细胞相关的不同社区，暗示巨噬细胞可能参与形成不同类型的TSME模式（例如，一个包含成纤维细胞/内皮细胞相关的巨噬细胞社区，另一个包含与树突状细胞/CD8 T细胞相关的巨噬细胞社区）。

结果2、泛癌样本中共识空间生态位

在识别局部细胞程序（LCP）的基础上，研究进一步考虑了更大空间范围内点位的邻域关系，从而定义了“生态位”。在12种癌症类型中，共发现了13个共识生态位（Niche_1 至 Niche_13）。这些生态位可大致分为两类：

生态位1-6：主要由恶性局部细胞程序（MLCP） 构成。

Niche_1：主要由肿瘤细胞组成，代表肿瘤细胞聚集、其他TME细胞浸润较少的区域。

Niche_2：肿瘤细胞与内皮细胞共定位。

Niche_3：肿瘤细胞与成纤维细胞共定位。

Niche_4：肿瘤细胞与巨噬细胞位于同一区域。

Niche_5和6：肿瘤内有淋巴细胞浸润的免疫微环境。

生态位7-13：主要由基质局部细胞程序（SLCP） 构成。

Niche_7：可能代表基质区中的血管结构。

Niche_8：以成纤维细胞为主。

Niche_9：间充质细胞与免疫细胞共存。

Niche_10：巨噬细胞与基质细胞共存。

Niche_11：巨噬细胞与其他免疫细胞共存。

Niche_12：包含浆细胞的MLCP和SLCP。

Niche_13：聚集了B细胞、常规树突状细胞（cDC）、CD4+ T和CD8+ T细胞，类似于三级淋巴样结构（TLS）的生态位。

重要发现：B细胞与浆细胞位于不同生态位，功能不同

Niche_12（浆细胞为主）：高表达浆细胞相关基因（如MZB1）和抗体基因（如IGHG1、IGKC），表明其浆细胞已发生抗体类别转换。

Niche_13（B细胞为主）：高表达B细胞相关基因（如MS4A1）和IGHD抗体基因，表明其B细胞未发生类别转换。

这表明B细胞和浆细胞定位在不同的空间微环境中，执行不同的生物学功能，并与胶质母细胞瘤（GBM）研究中的发现一致。

验证与高精度数据对比

利用高分辨率空间转录组数据（Vizgen MERFISH）验证了上述发现，在亚细胞分辨率下同样观察到了B细胞介导、浆细胞介导的生态位，以及巨噬细胞与上皮细胞/免疫细胞的共定位模式。

肿瘤内外异质性

肿瘤内异质性：多数样本包含多个生态位，反映了TSME的瘤内多样性。其中，皮肤鳞状细胞癌（CSCC）、肺鳞癌（LUSC）和胰腺癌（PAAD）的多样性更为广泛。

肿瘤间异质性：根据生态位组成相似性，样本可分为11个cluster。

以Niche_1为主：在前列腺癌（80%）和肝癌（50%）中富集，提示多数患者TME细胞浸润较少（“免疫冷”肿瘤）。

以Niche_4为主：在胶质母细胞瘤（21.9%）中富集。

以Niche_9为主：在CSCC（62.5%）和PAAD（42.3%）中富集。

值得注意的是，同一癌症类型中仍可观察到多种生态位类型。

临床关联：

在结直肠癌中，微卫星不稳定（MSI-H）患者富含免疫细胞富集的生态位，而微卫星稳定（MSS）患者则以Niche_1为主。

在肝癌免疫治疗队列中，无应答者多属于Niche_1主导的cluster，而应答者则富集Niche_12、Niche_13等免疫富集生态位。

与基于基因表达聚类得到的空间域相比，本研究中基于细胞类型组成定义的生态位能更好地刻画肿瘤空间微环境的异质性，尤其能区分免疫细胞的复杂性。与TCGA的bulk RNA-seq免疫亚型相比，本研究定义的生态位能更精细地捕获患者间免疫组分的多样性。

结果3、生态位内配体-受体（LR）相互作用的系统解析

为每个空间点位定义LR相互作用评分，该评分基于配体和受体的协同基因表达。

通过先比较样本内不同点位的LR评分，再采用荟萃分析整合所有样本的结果，来筛选与生态位相关的LR对。

生态位特异性与共享性LR

特异性LR：某些LR对仅存在于单一生态位中。例如，EREG-EGFR+ERBB2仅存在于Niche_1（肿瘤细胞聚集区）；PTPRC-CD22仅存在于Niche_13（TLS样生态位）。

共享LR：另一些LR对存在于多个生态位中。例如，Niche_2和Niche_7（两者均以内皮细胞为主）共享20个共同的LR相互作用。

主要细胞类型相同但共定位细胞不同的生态位比较

内皮细胞主导的生态位（Niche_2 vs. Niche_7）：

共享：VEGFB-VEGFR1、ANGPTL4-CDH5。

Niche_7独有：ANGPT2-TEK、VEGFC-VEGFR2。

Niche_2独有：VEGFA-VEGFR1R2、SEMA3F-NRP2+PLXNA2（可能代表肿瘤细胞与内皮细胞间的通讯）。

成纤维细胞主导的生态位（Niche_3 vs. Niche_8）：

共享：COMP-ITGA3、LAM2-CD44。

Niche_8独有：FGF1-FGFR1、FGF10-FGFR1。

Niche_3独有：INHBA-ACVR1B+ACVR2A、SEMA5A-PLXNA1（可能代表肿瘤细胞与成纤维细胞间的通讯）。

巨噬细胞相关的生态位（Niche_4、10、11）：同样存在共同和特有的LR相互作用，反映巨噬细胞与其他细胞类型的通讯。

信号通路水平的分析

生态位特异性通路：

EPHA通路和NECTIN通路仅富集于Niche_1。NECTIN家族蛋白参与细胞粘附和增殖，与多种癌症的不良预后相关。

免疫相关生态位共享的通路：

COMPLEMENT（补体）、MHC-II、ICAM、ITGAL-ITGB2等通路在多个免疫相关生态位（Niche_10、11、12、13）中富集，表明这些是免疫细胞相关生态位的共同特征。

同一通路在不同生态位中的差异：

以NOTCH通路为例，它在Niche_1、Niche_2、Niche_7中均富集，但使用的配体不同：

DLL3介导的LR仅存在于Niche_1。

DLL1和DLL4介导的LR存在于Niche_2和Niche_7，提示其在血管生成中的作用。

类似现象也存在于COLLAGEN（胶原蛋白） 和LAMININ（层粘连蛋白） 等信号通路中。

结果4、免疫相关配体-受体相互作用在免疫调节中的作用

趋化因子与其受体的相互作用

广泛存在的相互作用：CXCL12-CXCR4 出现在多个生态位（Niche_7至Niche_13），这与已知的其在纤维化、血管生成、浆细胞迁移及免疫微环境形成中的多种功能一致。

特定生态位的相互作用：

CCL15-CCR1 仅存在于 Niche_1。

CCL7-CCR1 仅存在于 Niche_4。

免疫生态位中的活跃相互作用：趋化因子相互作用在 Niche_11 和 Niche_13 中最活跃。

共同存在的相互作用：CXCL9-CXCR3、CCL5-CCR5、CCL5-CCR1、CXCL10-CXCR3（其中CXCL9被认为能促进抗肿瘤免疫和免疫治疗反应）。

生态位特异性差异：

Niche_11 特有：CXCL16-CXCR6、CCL3-CCR5。

Niche_13（TLS样生态位） 特有：CCL21-CCR7、CCL19-CCR7、CXCL13-CXCR5（这些是三级淋巴样结构中常见的趋化因子）。

白细胞介素（IL）与其受体的相互作用

IL1B-IL1R2：仅存在于 Niche_4。已知巨噬细胞分泌的IL1B会促进肿瘤进展。

IL7-IL7R+IL2RG：在 TLS样生态位（Niche_13） 中最强。IL7在TLS形成中参与淋巴细胞的招募。

IL15-IL15RA+IL2RG：存在于 Niche_11。IL15与T细胞和自然杀伤（NK）细胞的增殖及活化相关。

值得注意的是，IL7和IL15同属IL-2家族，在激活T细胞方面有相似的生物活性，但它们在不同的生态位中发挥作用。

免疫激活与免疫抑制相互作用

Niche_13 比其他生态位拥有更多的免疫激活和免疫抑制配体-受体对，这与其多样的免疫细胞类型一致。

关键的免疫检查点 PD-1（PDCD1）与PD-L1（CD274） 的相互作用也发生在 Niche_13 中。

临床预后关联分析（基于TCGA数据）

与更好生存相关的相互作用（至少在7种肿瘤类型中）：

主要与 Niche_11 和 Niche_13 相关，例如：CXCL9-CXCR3、CXCL11-CXCR3、CCL19-CCR7、CXCL13-CXCR5、IL15-IL15RA+IL2RB、IL7-IL7R+IL2RG、CD274-PDCD1 等。

与更差生存相关的相互作用：

IL1B-IL1R2（仅存在于 Niche_4）与7种肿瘤类型的不良预后相关。

结果5、细胞类型的基因表达依赖于其所处生态位

同一种细胞类型可能参与不同的生态位。为了理解细胞内基因表达与其所处局部微环境（生态位）之间的关联，研究提出了一种识别生态位相关细胞类型特异性差异表达基因的方法。

肿瘤细胞的NCDEGs分析

分析重点：在主要由恶性局部细胞程序主导的生态位（Niche_1至Niche_6）中，分析肿瘤细胞的差异表达基因。以几乎纯肿瘤细胞的Niche_1作为参考基准。

Niche_5和Niche_6（含淋巴细胞的免疫浸润生态位）：

肿瘤细胞中高表达的基因富集在同种异体移植排斥和干扰素-γ反应通路。

代表基因：CFB。

这些免疫相关的转录程序可能抑制肿瘤进展。

Niche_3（肿瘤+成纤维细胞）和Niche_4（肿瘤+巨噬细胞）：

肿瘤细胞中高表达的基因富集在上皮-间充质转化程序。

这表明，与成纤维细胞或巨噬细胞共定位的肿瘤细胞具有更强的EMT潜力，而EMT是肿瘤转移的原因之一。

Niche_3的代表基因：LAMC2（已知与成纤维细胞浸润相关）。

此外，Niche_4中的肿瘤细胞还高表达与上皮衰老相关的基因（如LCN2）。已知衰老细胞会分泌吸引巨噬细胞的因子，LCN2的表达也与软脑膜转移中的巨噬细胞有关，这在一定程度上解释了Niche_4中巨噬细胞与肿瘤细胞的共定位。

巨噬细胞的NCDEGs分析

比较对象：Niche_11中与其他免疫细胞共定位的巨噬细胞，对比Niche_4中与肿瘤细胞共定位或Niche_10中与基质细胞共定位的巨噬细胞。

与已知巨噬细胞亚型的关联：

Niche_11中高表达的基因与 2_C3Mac 和 8_IFNGMac 亚型相关。

Niche_4或Niche_10中高表达的基因与 6_SPP1AREGMac 和 3_ICMac 亚型相关。

M1/M2极化：Niche_11中高表达的基因与M1型极化相关（抗肿瘤），而Niche_4/10中高表达的基因与M2型极化相关（促肿瘤）。

Niche_11特异性巨噬细胞基因：

识别出12个在Niche_11巨噬细胞中高表达的基因，包括：

LYZ、C1QC

多个抗原呈递相关基因（如 HLA-DQA1、HLA-DQB1、B2M、CD74），提示这些巨噬细胞具有活跃的免疫功能，尤其是在抗原呈递方面。

识别出4个在Niche_11巨噬细胞中低表达的基因，包括SPP1。SPP1是已知与不良预后相关的巨噬细胞亚型标志物。

肿瘤细胞的基因表达状态高度依赖于其所在生态位：位于免疫浸润区域的肿瘤细胞表达免疫相关抑制程序；而与成纤维细胞或巨噬细胞共定位的肿瘤细胞则表达EMT和衰老相关程序，更具侵袭潜力。

巨噬细胞的基因表达同样高度依赖于其空间位置：与免疫细胞共定位的巨噬细胞（Niche_11）呈现M1样、抗原呈递活跃的表型；而与肿瘤细胞或基质细胞共定位的巨噬细胞（Niche_4/10）则呈现M2样、预后不良相关的表型。这些发现深刻揭示了空间微环境对细胞功能状态的塑造作用。

结果6、生态位与患者生存及治疗反应相关

利用解卷积方法，将bulk RNA测序数据中每个样本标注为最可能的生态位类型，从而进行大规模临床关联分析。

生态位类型与患者总生存期显著相关

对来自11种癌症类型的5,162名患者进行预后分析，结果显示：

较长总生存期相关的生态位：Niche_11样、Niche_12样、Niche_13样。

较差总生存期相关的生态位：Niche_9样、Niche_10样、Niche_4样。

巨噬细胞相关生态位的比较：Niche_11样患者的OS显著长于Niche_4样和Niche_10样患者。

生态位类型与免疫治疗反应显著相关

对来自8个免疫治疗队列的776名患者治疗前的RNA测序数据进行分析：

Niche_13样：与更好的免疫治疗反应相关。

Niche_4样：与免疫治疗无反应显著相关。

尽管各队列间的效应值存在差异，但趋势一致。

巨噬细胞的空间分布是关键生物标志物

基于以上发现，研究进一步聚焦于巨噬细胞与不同细胞类型的共定位：

巨噬细胞 + 肿瘤细胞（Niche_4）：与不良预后相关。

巨噬细胞 + 其他免疫细胞如T细胞和cDC（Niche_11）：与良好预后相关。

高精度空间蛋白成像技术验证

为了在单细胞空间分辨率下验证上述现象，研究利用4个多重蛋白成像数据集，根据巨噬细胞与肿瘤细胞或T细胞的空间距离进行分类：

M01：邻近T细胞的巨噬细胞。

M02：邻近肿瘤细胞的巨噬细胞。

根据M01和M02的比例将患者分为四组：G1（M01高/M02低）、G2（M01高/M02高）、G3（M01低/M02低）、G4（M01低/M02高）。

验证结果：

生存分析：在非小细胞肺癌、肝细胞癌、乳腺癌三个数据集中，G1患者总生存期最好，G4患者总生存期最差。

免疫治疗反应分析：在黑色素瘤抗PD-1治疗队列中，应答者中M01高的患者（G1和G2）比例显著更高；无反应者中G4亚组的比例呈增加趋势。

结论与意义

生态位类型，尤其是巨噬细胞的空间分布，与患者的生存预后和免疫治疗反应密切相关。具体而言：

Niche_4（巨噬细胞与肿瘤细胞共定位） → 不良预后、免疫治疗耐药。

Niche_11/13（巨噬细胞与免疫细胞共定位/TLS样结构） → 良好预后、免疫治疗应答。

这些结果与多项单癌种研究（如小细胞肺癌中的MT2生态位、结直肠癌中的C1QC+巨噬细胞-CD4+ T细胞生态位）一致。研究强调，巨噬细胞的空间分布是一个重要的预后及治疗反应生物标志物，具有未来临床应用的潜力。

最后，来看看方法

visium数据分析

niche分析

niche的通讯分析

生活很好，有你更好。