visium HD & 分子动力学--内皮SMAD1-MCAM轴通过LAMB1-ITGB1信号通路促进舒尼替尼耐药及透明细胞肾细胞癌的进展

作者，Evil Genius

大家能接受自己是同学中混得最差的么？大家愿意接受自己的人生算失败么？

命运这种事，真的让人难以捉摸，起起落落。

山西长治市沁源县5月22号煤矿瓦斯爆炸大家听说了吧，82死2人失联，谁能想到2026年了煤矿还发生这种事，我爸年轻的时候就是下煤矿遇到爆炸浑身烧伤，这辈子再也没去过煤矿，也落下了终身残疾。

很多人可能不理解为什么非要下煤矿？在山西，普通人想挣点钱，只有下煤矿这一条路，而且也不是想去就能去的，需要很多钱打点关系才有可能吃上这碗饭。

如果这一难就是永别，大家还会计较让自己不开心的人和事么？很多人我们说了再见，其实再也没见。

多组学来了，大家准备好了么？基因组、单细胞空间分析在于找到原因，找到靶点，分子对接、分子动力学在于解决问题，恢复健康的生态。

今天我们分享文献

知识积累

透明细胞肾细胞癌（ccRCC）具有高转移潜力和对常规治疗频繁耐药的特点，这凸显了深入理解其肿瘤微环境的必要性。

尽管免疫治疗和靶向治疗（VEGF-TKI）已有进展，但约1/3患者初诊即转移，局限性患者中30%最终会复发，且相当一部分患者存在原发或获得性耐药。

肿瘤微环境（TME）的关键作用：

TME（含基质、免疫和血管成分）是肿瘤进展和耐药的核心决定因素。

临床研究显示，基质富集表型的ccRCC患者对免疫联合靶向治疗获益有限，提示特定基质结构主动促进耐药与进展。

内皮细胞（ECs）的研究空白：

ECs不仅构成血管，还可重塑细胞外基质（ECM）、影响免疫迁移、形成“转移生态位”。

在其他癌种中已发现特异的促转移EC亚群，但在ccRCC中尚未明确；ECs如何与侵袭性肿瘤细胞空间互作以介导肿瘤-内皮对话，也基本未知。

结果1、EMT样肿瘤细胞与内皮细胞有密切相互作用，并在ccRCC中预测不良预后

构建多组学数据库：包含10个单细胞RNA测序（scRNA-seq，共106万+细胞）、3个空间转录组（含高精度10x Visium HD）、12个bulk RNA-seq队列（2000+例）。

生信分析：通过拟时序分析、细胞间通讯建模、基因集富集分析（GSEA），锁定MCAM+ TipEC亚群为EMT和转移的关键介导者。

空间验证：使用空间共定位和Visium HD分析确认细胞空间邻近性。

因果实验：包括体外功能实验、siRNA敲低拯救实验、体内小鼠模型。

临床模型：通过机器学习（101种算法组合）构建预后模型，用于风险分层和生存预测。

EMT样肿瘤细胞（RCC_EMT）

鉴定与分型：在发现队列（GSE207493）中注释出8种主要细胞谱系，其中肿瘤细胞进一步分为6个亚群，RCC_EMT是其中之一。

功能特征：该亚群显著富集转移相关通路（如EMT、细胞-基质黏附、ECM重塑），与不良预后显著相关。

临床相关性：

在多个数据集中，RCC_EMT高浸润与总生存期缩短相关。

该亚群在转移灶和晚期肿瘤中比例逐渐升高。

分化潜能：CytoTRACE分析显示RCC_EMT具有较高的干性评分；Slingshot轨迹分析将其定位为中间过渡态，活跃于MAPK信号和ECM重塑。

空间分布：空间转录组显示RCC_EMT在TME中广泛分布，并与内皮细胞存在强烈的细胞间通讯；Visium HD进一步证实二者在肿瘤微环境中物理位置上紧密相邻。

结果2、MCAM+内皮细胞在空间上更接近肿瘤细胞，并与ccRCC的不良预后相关

MCAM+ ECs与肿瘤细胞空间邻近且预示不良预后

细胞间通讯分析

利用CellChat和CellphoneDB预测肿瘤微环境中的信号网络。

发现恶性肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用最强，且这一结果在8个独立单细胞ccRCC数据集中得到验证。

RCC_EMT亚群是主要互作方

在所有肿瘤细胞亚群中，RCC_EMT与内皮细胞的通讯频率最高。

RCC_EMT与内皮细胞的互作强度与不良临床结局显著相关。

MCAM+ ECs的鉴定与特征

将内皮细胞进一步细分为11个亚群，其中包括MCAM+ TipEC（即MCAM+ ECs）。

MCAM+ ECs在多个队列中均被证实为不良预后的一致风险因素。

功能富集分析显示，MCAM+ ECs富集了转移相关通路，如：

ECM-受体相互作用

细胞黏附

EMT驱动通路

空间与临床验证

空间转录组学证实MCAM+ ECs在肿瘤组织中广泛分布，并与RCC_EMT细胞在空间上显著邻近。

多重免疫组化（mIHC） 显示：

在转移性ccRCC患者的原发灶中，MCAM+ ECs的丰度显著高于非转移患者。

MCAM+ ECs是促进侵袭性ccRCC中肿瘤-内皮细胞互作的关键基质成分，其空间邻近性与不良预后密切相关。

结果3、MCAM+ 内皮细胞通过 LAMB1-ITGB1 信号轴驱动肿瘤转移

MCAM+内皮细胞通过高表达LAMB1，与肿瘤细胞建立紧密的物理和信号通讯，从而驱动ccRCC转移。

MCAM+内皮细胞具有高干性和高可塑性

干性更高：CytoTRACE分析显示其干性评分显著高于其他内皮亚群。

标志物验证：流式细胞术证实CD44、CD105（干性标志物）表达升高。

功能更强：成管实验中血管生成能力显著增强。

分化状态：Slingshot轨迹分析将其定位为中间过渡态，在TME中发挥承上启下的作用。

通路激活：沿其分化轨迹，EMT、MAPK信号、上皮迁移等促转移通路被激活。

MCAM+内皮细胞是主导性的信号发送者

传出信号最强：在所有内皮亚群中，MCAM+ ECs的传出相互作用强度最高。

与肿瘤细胞互作最强：与恶性肿瘤细胞（尤其是RCC_EMT）的通讯频率和强度最高，并在多个数据集中验证。

空间上紧密邻近：

空间转录组证实二者明显共定位。

Visium HD高精度分析显示：在肿瘤细胞周围200像素半径内，MCAM+ ECs丰度最高；且二者之间的最小欧氏距离显著短于其他内皮亚群。

关键分子机制：LAMB1-ITGB1轴

核心通讯轴：LAMININ信号通路是MCAM+ ECs与肿瘤细胞之间最一致的通讯轴。

配体-受体对：LAMB家族配体与整合素家族受体（如ITGB1）之间具有高亲和力相互作用。

LAMB1是关键效应分子：

LAMB1在MCAM+ ECs中特异性地高表达（mRNA和蛋白水平均显著上调）。

相比之下，LAMB4虽有信号活性，但表达与分期无关且与良好预后相关，不介导促肿瘤效应。

结论：LAMB1是介导MCAM+ ECs促肿瘤效应的关键配体。

LAMB1-ITGB1轴是驱动ccRCC转移的关键通路

在TCGA-KIRC、Checkmate、CPTAC-ccRCC等多个独立队列中，LAMB1高表达均与显著缩短的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS） 相关。

TGB1是LAMB1的特异性受体

空间配体-受体分析显示：LAMB1-ITGB1对的空间兼容性评分最高。

相关性分析：在整合素家族中，ITGB1与LAMB1表达的正相关性最强。

多重免疫荧光（mIF） 证实：LAMB1-ITGB1复合物在肿瘤细胞和MCAM+ ECs中原位空间共定位。

免疫共沉淀（Co-IP）：在786-O和OSRC2细胞中，LAMB1与内源性ITGB1特异性相互作用。

分子结构基础

分子对接和分子动力学模拟：

预测LAMB1与ITGB1之间存在稳定的结合界面，由氢键和盐桥网络维持。

RMSF分析证实复合物残基在模拟过程中具有热力学稳定性。

功能验证：可溶性LAMB1是主要效应分子

可溶性 vs. 基质结合型LAMB1：可溶性LAMB1（rhLAMB1）更能显著促进ccRCC细胞的迁移和侵袭，是驱动转移相关表型的主要因素。

Western blot：可溶性LAMB1显著增强ccRCC细胞的黏着斑组装。

LAMB1-ITGB1轴的功能机制

诱导EMT：rhLAMB1刺激后，肿瘤细胞中N-cadherin、Vimentin、Snail上调，E-cadherin下调，证实EMT表型诱导。

促进迁移和侵袭：rhLAMB1显著增强ccRCC细胞的迁移和侵袭能力。

ITGB1敲低可逆转：siRNA介导的ITGB1敲低能有效消除rhLAMB1的促转移效应。

间接共培养验证：MCAM+ ECs可显著增强ccRCC细胞的转移潜能，而加入中和性抗ITGB1抗体能显著减弱这一效应。

受体拮抗实验：干预ITGB1可有效阻断rhLAMB1诱导的促肿瘤效应。

结果4、SMAD1是驱动正常内皮细胞（EC）转化为促转移的MCAM+ EC的核心转录因子

转录轨迹重建：从正常EC到MCAM+ EC的演化

维度 reduction：正常EC与MCAM+ EC在转录组上明显分离（Fig. 6A）。

Monocle2轨迹分析：

从正常表型向MCAM+状态逐步演化。

伴随抗原递呈和TNF信号通路逐渐抑制。

同时激活转移相关程序：细胞-基质黏附、EMT、黏着斑信号。

关键分子动态：在过渡过程中，SMAD1、LAMB1和MCAM的表达逐步上调。

通路活性：MCAM+ EC中转移相关通路活性显著高于正常EC。

SCENIC分析鉴定SMAD1为关键转录因子

候选TF包括SOX11、RELB、SOX4、MAFK，但SMAD1在多个验证队列中均显示出最高的调控特异性评分（RSS）。

调控网络推断：SMAD1位于调控子中心，控制LAMB1和MCAM的表达。

GeneSwitches分析：SMAD1激活是在正常EC分化分支点上的关键“开启”开关，与其靶基因上调同步。

SMAD1直接转录激活MCAM和LAMB1

数据库交叉验证（KnockTF、hTFtarget、PROMO、GTRD、JASPAR）：SMAD1是MCAM和LAMB1的上游TF。

相关性：TCGA-KIRC队列中，SMAD1表达与MCAM、LAMB1水平呈显著正相关。

ChIP-qPCR和双荧光素酶报告实验：

SMAD1直接结合MCAM和LAMB1的启动子区域。

定点突变SMAD1结合基序后，荧光素酶活性显著消失，证明直接转录激活（Fig. 6N）。

功能验证（HUVEC细胞）：

过表达SMAD1 → LAMB1和MCAM的mRNA和蛋白水平显著上调。

沉默SMAD1 → 抑制其表达。

临床相关性：

相比其他TF，SMAD1与LAMB1的正相关性最强。

SMAD1表达与EMT基因特征呈正相关，证实其驱动促转移内皮状态。

上游诱导信号：肿瘤来源的BMP4通过BMPR2激活SMAD1

细胞间通讯分析：肿瘤细胞与MCAM+ EC之间的信号强度最高。

CellChat：BMP4-BMPR2配体-受体对的通讯评分最高。

NicheNet分析：肿瘤来源的BMP4信号是激活MCAM+ EC中SMAD1的主要候选因子。

体外验证（HUVEC）：

rhBMP4刺激 → SMAD1磷酸化水平显著增强，MCAM和LAMB1表达上调。

BMPR2抑制剂CDD1653处理 → 有效阻断上述激活效应，确立BMP4-BMPR2-SMAD1轴是MCAM+ EC重编程的关键诱导通路。

结果5、基于MCAM特异性标志物的MERS预后模型开发

MERS——基于MCAM+ EC的预后风险模型

MCAM+ EC特异性标志物的鉴定

差异表达分析：在多个独立ccRCC队列中识别MCAM+ EC特异性的标志基因。

功能富集分析：这些标志基因主要参与：

ECM（细胞外基质）组织

细胞-基质连接形成

转移相关生物学过程

模型构建：101种机器学习算法组合

整合了10种机器学习算法，形成101种组合框架。

随机生存森林（RSF）算法表现最优，一致性指数（C-index）最高。

最终模型命名为：MERS（基于MCAM+ EC的风险评分）。

模型预后性能验证

生存分析：

高MERS评分患者的总生存期显著短于低风险组。

在多个独立验证队列中保持稳定的预测准确性。

1年、3年、5年的AUC值均超过0.70。

主成分分析（PCA）：高风险组与低风险组明显分离，证实MERS具有良好的分层能力。

MERS与临床病理特征的关联

与肿瘤进展正相关：

MERS评分从T1期到T4期呈逐步升高趋势。

淋巴结阳性（N1）和转移性（M1）患者的MERS评分显著高于N0和M0对照组。

区分转移能力：ROC曲线分析证实MERS是区分转移（M1）与非转移（M0）病例的有效分类器。

MERS的优越性：优于传统指标和已有模型

对比标准临床病理变量（年龄、性别、TNM分期）：MERS在所有测试队列中的C-index均更高。

对比已发表的ccRCC预后特征：MERS同样表现出更优的预测性能。

结果6、 MCAM+ 内皮细胞来源的 LAMB1 促进肾细胞癌对舒尼替尼的耐药

EMT 所固有的表型可塑性使得肿瘤细胞能够适应 TKI 治疗诱导的恶劣微环境条件。

表型相关性分析鉴定出舒尼替尼耐药亚群（Scissor+），这些细胞主要富集在 RCC_EMT 和 RCC_Inflammatory 集群中。细胞间通讯分析显示，与其他内皮亚群相比，MCAM+ EC 与这些 Scissor+ 耐药细胞表现出最强的通讯权重。配体-受体分析确定 LAMB1 是 MCAM+ EC 中主要表达的配体，提示其通过旁分泌信号发挥潜在调控作用

在临床上，与有反应的患者相比，LAMB1 表达在对舒尼替尼原发耐药的患者中显著升高，而 ITGB1 水平则与药物反应类别无显著相关性。然而，Kaplan-Meier 分析显示，LAMB1 和 ITGB1 的高表达均与较差的总生存期密切相关

在体外验证了 LAMB1 介导耐药的功能作用。rhLAMB1 处理显著降低了 786-O 和 OSRC2 细胞对舒尼替尼的敏感性，表现为 IC50 值显著升高。与此一致，成像实验表明，与 PBS 对照组相比，在舒尼替尼压力下，补充 rhLAMB1 有效挽救了细胞活力并维持了细胞增殖。

此外，体内研究显示，虽然舒尼替尼治疗显著抑制了 ccRCC 肿瘤生长，但共植入 MCAM+ EC 显著降低了肿瘤的治疗敏感性。这种促耐药效应是 MCAM+ 亚群所特有的，因为 MCAM− EC 未能对恶性肿瘤细胞产生类似的保护作用。重要的是，在 MCAM+ EC 共植入组中，给予中和性抗 ITGB1 抗体可部分但显著地恢复对舒尼替尼的治疗敏感性。这些数据表明，MCAM+ EC 来源的 LAMB1 促进了 ccRCC 中舒尼替尼耐药表型的形成。

结果7、MCAM+ 内皮细胞来源的 LAMB1 通过 RhoA/ROCK 轴促进 ccRCC 进展

通过转录组测序发现，rhLAMB1处理ccRCC细胞后显著上调SCD、TXNIP、MATN2等基因，GO和GSEA富集分析表明这些差异基因主要参与黏着斑组装、Rho蛋白信号转导、整合素相互作用及ECM相关通路，提示RhoA是其关键下游效应分子。临床数据进一步证实LAMB1表达与EMT特征及Rho信号评分呈正相关。功能实验中，ROCK特异性抑制剂Y27632可有效逆转rhLAMB1诱导的细胞迁移和侵袭能力；Western blot显示rhLAMB1激活RhoA信号并诱导EMT标志物变化（N-cadherin、Vimentin、Snail上调，E-cadherin下调），而敲低ITGB1、使用Y27632或沉默ROCK1均可消除这些效应。体内实验也证实抑制ITGB1可减少肺转移并延长生存期。综上，MCAM+ EC来源的LAMB1通过ITGB1-RhoA-ROCK轴激活下游信号，促进EMT及ccRCC进展。

最后，来看看方法

visium HD

分子对接 + 分子动力学

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