AI驱动蛋白设计中经过湿实验验证的方法全景

文献来源：Current Opinion in Structural Biology 2026, 98: 103272 DOI：10.1016/j.sbi.2026.103272 作者：Clayton W. Kosonocky¹, Sarah Alamdari², Kevin K. Yang², Ava P. Amini² 机构：¹ 德克萨斯大学奥斯汀分校；² Microsoft Research（剑桥）

导读：为什么这篇综述值得精读？

近年来，AI蛋白质设计领域论文产出呈爆炸式增长，但绝大多数工作止步于计算层面的评估——模型生成的序列是否真的在实验室中起效，往往语焉不详。这篇综述恰好填补了这一空白：它系统梳理了横跨完整"数据→模型→实验"流程、并经过实验验证的AI蛋白质设计方法，提供了迄今为止最为全面的实验成功率参考数据库。

一、背景：从传统方法到AI驱动的范式转变

蛋白质设计的核心挑战在于导航氨基酸序列、三维结构与生物功能之间的复杂映射关系。

1.1 传统方法的局限

传统计算蛋白质设计依赖：

• • 物理模拟（分子动力学、量子力学/分子力学）
• • 经验打分函数（如 Rosetta 能量函数）
• • 专家启发式规则

这些方法的主要瓶颈包括：计算成本高昂、难以大规模扩展、高度依赖高质量结构信息，以及对序列空间的采样效率低。

1.2 AI方法的优势

AI模型通过从大规模生物数据中直接学习序列—结构—功能关系，绕过了上述限制：

正是这种数据规模的优势，使得深度学习模型能够捕捉传统方法难以建模的统计规律。

二、端到端设计流程详解

作者将AI驱动蛋白质设计拆解为四个相互依存的核心环节：

数据集构建 ──▶ 模型训练 ──▶ 候选生成与筛选 ──▶ 实验验证
     ▲                                  │
     └──────── 实验反馈回路 ◀──────────┘

2.1 数据集构建

数据质量是整个流程的根基。关键考量包括：

• • 序列多样性：覆盖蛋白质序列空间的广度，影响模型的泛化能力
• • 结构注释质量：高分辨率结构（X射线晶体学、冷冻电镜）vs. 同源建模结构的权衡
• • 功能标注：结合数据（Kd值）、酶活数据等功能信息的覆盖程度
• • 数据偏差：PDB中小分子配体代表性不足，是蛋白质—小分子结合蛋白设计成功率偏低的根本原因之一

2.2 模型架构：两大技术路径

路径一：基于结构的方法（Structure-Based）

结构背景输入
      │
      ▼
骨架生成模型（Backbone Design）
[RFdiffusion, Chai-2, LatentX...]
      │
      ▼
固定骨架序列设计（Fixed-Backbone Sequence Design）
[ProteinMPNN, LigandMPNN, CARBonAra...]
      │
      ▼
结构预测验证与筛选
[AlphaFold2, Boltz-1, ESMFold...]

条件输入的演进：

• • 早期模型：仅接受残基坐标或骨架原子
• • 近期模型：支持全原子生物分子表示（包括小分子、核酸）及动态构象状态

路径二：基于序列的方法（Sequence-Based）

序列语言模型完全绕过结构信息，直接在序列空间中操作：

• • 自回归模型（如 ProGen2, ProGen3）：从左到右逐步生成序列
• • 掩码语言模型（如 EvoDiff, PepMLM）：通过填充缺失位置生成多样序列
• • 条件生成策略：在部分序列、对齐同源序列、或特定酶家族分布上条件化生成

值得关注的发现：序列语言模型在结合蛋白设计（传统上被视为结构任务）上展现出竞争力，可能源于模型从协同进化信号中隐式学习到了结构约束。

统一方法与混合策略

部分模型打破了结构/序列的二元划分：

• • 序列—结构联合生成（Chroma, RoseTTAFold Sequence Space Diffusion）：同步生成骨架与序列
• • 可微分结构预测器反向传播（BindCraft, Germinal）：通过梯度优化满足生物/物理约束
• • 全原子设计（RFdiffusion All-Atom, RFdiffusion3）：直接在全原子层面建模生物分子相互作用

2.3 候选生成与筛选

典型的筛选流程（按计算成本递增）：

1. 1. 结构预测置信度过滤：丢弃 pLDDT / pTM 低于阈值的候选
2. 2. Rosetta 能量打分：剔除能量不利或非物理结构
3. 3. 序列/结构多样性聚类：维持候选集的多样性，避免冗余实验
4. 4. 人工检查：对关键位点（结合界面、催化残基）的人工审核

2.4 实验验证

验证的层次结构（分辨率递增，通量递减）：

三、三大应用领域深度解析

3.1 结合蛋白（Protein Binders）

设计挑战

结合蛋白设计要求模型精确捕捉蛋白质—靶标界面的互补性，需要同时优化形状互补、静电相互作用和疏水效应。

主流方法与代表模型

关键实验数据

TNF-α 的特殊性：在所有测试模型中，仅 Chai-2 成功生成了 TNF-α 结合蛋白，揭示了该靶标界面的独特挑战性（如高度平坦的结合表面）。

蛋白质—小分子结合蛋白的困境

尽管 RoseTTAFold All-Atom、LigandMPNN、LASErMPNN 等模型已展示了蛋白质—小分子设计的初步成功，但成功率普遍低于蛋白质—蛋白质结合蛋白。根本原因在于：PDB中小分子配体的化学多样性覆盖极为有限，相对于真实化学空间的广度，训练数据严重不足。

当前局限

• • 大多数验证基于体外结合，缺乏细胞或动物模型中的功能验证
• • 免疫原性控制是治疗应用的核心挑战（非自身表位、异常结构基序可引发免疫反应）
• • 脱靶结合（特别是在复杂生物环境中）亟需更系统的评估

3.2 抗体设计（Antibody Design）

独特挑战

抗体设计面临的技术障碍与一般结合蛋白存在本质差异：

数据层面：

• • 尽管 SAbDab 收录了几乎全部已知抗体结构，PDB中抗体结构覆盖度依然有限
• • Observed Antibody Space、AbRank 等序列库收录数亿条序列，但仅小部分有原子分辨率结构
• • V(D)J 重组 + 体细胞超突变产生的 CDR H3 极端序列多样性，导致个体抗体几乎无深度同源家族

模型层面：

• • 基于多序列比对（MSA）的方法（AlphaFold2风格）在抗体上表现受限——协同进化信号稀疏
• • CDR环的构象多样性超出通用蛋白质折叠模型的建模能力
• • 结构基础扩散模型倾向于生成α螺旋主导的CDR环（与真实无序CDR环不符）

技术突破：引入抗体专属生物先验

近年关键进展在于将领域专属知识注入模型设计：

• • Germinal：引入自定义损失函数，惩罚模型生成α螺旋CDR结构，引导生成更真实的无序CDR环；同时支持表位定向设计
• • IgGM：支持框架区工程化、亲和力成熟（结合界面系统优化）与人源化（减少免疫原性）的一体化设计流程
• • mBER：百万级实验筛选支持的可控从头抗体设计，实现对145个靶标的广覆盖
• • RFantibody：原子级精确度的抗体设计，在病毒靶标上通过冷冻电镜验证

关键实验数据

治疗开发视角

AI抗体设计正从 CDR 重设计向全流程设计演进，但以下属性仍面临数据限制：

• • 非蛋白质抗原（聚糖、脂质、核酸）的识别设计
• • 高精度人源化（人源化程度 vs. 亲和力的权衡）
• • 可开发性（aggregation propensity, thermal stability, viscosity）

3.3 酶设计（Enzyme Design）

为何最难？

酶设计在三个应用方向中挑战最大，因为它要求模型同时建模：

1. 1. 蛋白质本身的折叠与稳定性
2. 2. 底物（往往是 PDB 中代表性不足的小分子）
3. 3. 催化机制：过渡态几何构型、活性位点静电环境、催化残基精确定向
4. 4. 动力学：需要多种构象状态，而非单一静态结构

催化涉及瞬态、高能量中间体，这些信息难以从静态结构中直接推断，可能需要结合量子力学/分子力学（QM/MM）、密度泛函理论（DFT）等物理方法提供先验。

方法演进路线

早期方法
├── 幻觉法（Hallucination）：trRosetta 反向传播设计荧光素酶
└── 骨架扩散 + 固定催化残基：PLACER
        │（限制：催化位点构象固定，设计空间受限）
        ▼
近期方法
├── 学习最优催化残基定位：RFdiffusion2
├── 全原子生物分子相互作用设计：RFdiffusion3
├── 催化基序骨架化：RiffDiff
└── 序列语言模型条件化生成：ZymCTRL, ProGen2, ProtGPT2

关键实验数据

展望：迈向任意催化机制

现有AI酶设计工具所覆盖的催化反应种类，仍仅是自然界已知酶反应的极小子集。突破方向在于：

• • 将 DFT 计算的过渡态几何作为设计约束（RFdiffusion2 已开始支持）
• • 整合分子动力学模拟（BioEmu、Boltzmann Generators）建模构象动态
• • 开发可将催化活性转化为可测量信号的通用高通量实验平台

四、跨应用领域的横向比较

五、核心论断与方法论启示

5.1 实验反馈是核心驱动力

文章最重要的论断之一：

进展的根本驱动力不是模型规模，而是实验数据的质量与覆盖度。

结合蛋白设计之所以进展最快，并非因为模型最复杂，而是因为 SPR/BLI 等结合实验高度可扩展，能够为模型提供大规模定量反馈。相比之下，酶设计因底物多样、缺乏标准化实验平台，进展相对分散。

5.2 数据稀缺性的具体体现

• • 蛋白质—小分子结合：小分子化学空间巨大，PDB覆盖率极低
• • 脱靶特异性：缺乏系统性的脱靶结合测量数据
• • 人源化：精确人源化需要大量配对的免疫原性测量数据
• • 酶底物多样性：不同底物需要完全不同的实验验证流程

5.3 "闭环"的真正含义

文章标题"Closing the Loop"不只是比喻：

计算假设 ──▶ 实验验证 ──▶ 数据反馈 ──▶ 模型迭代改进
    ▲                               │
    └────────────────────────┘

当前的主要断点：

1. 1. 大多数实验验证为体外结合，缺乏生理相关环境中的功能验证
2. 2. 成功数据共享不成问题，但失败数据（阴性结果）的系统收集与共享严重不足
3. 3. 设计规模（数十到数百候选）与实验通量的匹配仍是瓶颈

六、未来方向与开放挑战

近期可期的突破点

• • 全原子建模的普及：RFdiffusion3、AtomWorks 等全原子模型将进一步降低蛋白质—小分子和蛋白质—核酸设计的门槛
• • 高通量实验平台：开发将更多功能属性（酶活、选择性、稳定性）转化为可扩展测量信号的实验方案
• • 抗体人源化与可开发性：将人源化和可开发性评估整合进设计循环

中长期挑战

• • 酶催化机制扩展：将 QM/MM 与 DFT 计算的先验知识系统集成到扩散/语言模型
• • 体内功能验证：从体外结合到细胞水平、动物模型的验证能力建设
• • 设计的可解释性：理解模型为何生成特定设计，而非仅追求黑盒优化
• • 多靶标与多功能设计：如广谱抗病毒、泛癌症靶向

小结

这篇综述的价值在于用实验数据说话。它提醒我们：在AI蛋白质设计领域，模型架构的创新固然重要，但实验反馈的质量、数量与多样性才是决定进步速度的真正瓶颈。

未来的突破不会来自单一的计算突破，而将来自计算与实验的深度协同——一个持续运转、不断校准的"闭合回路"。