顶刊分享（visium HD）--利用CRISPR筛选测序揭示空间分辨的功能基因组学

作者，Evil Genius

到这一篇，我所搜集的关于visium HD实验类文章已经达到50篇了，大家做了HD的要加油赶紧发文章了。

今天我们分享文献，文章的核心目的：将基因扰动与空间表型及信号通路联系起来。

知识积累

生物系统具有内在的空间组织性，细胞间的相互作用和分子过程都发生在特定的空间背景下。

在空间生物学领域的分析中，空间转录组学已被证明是一种强大的方法，能够研究组织结构、空间嵌入的基因表达模式、细胞群落以及细胞间相互作用。

基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术利用sgRNA引导Cas9蛋白进行靶向基因组编辑，通过将基因扰动与特定表型（如细胞生长、活力和标志基因表达）直接联系起来，彻底改变了功能基因组学研究。这种方法可以通过混合式CRISPR筛选扩展到高通量水平，从而系统性地研究基因功能。

将混合式CRISPR筛选与空间转录组学相结合，为鉴定与空间功能表型相关的基因以及阐明潜在的调控通路提供了独特的机会。已有研究利用空间蛋白质组成像技术，基于特定局部扩展扰动中的标志蛋白来表征免疫浸润表型。最近，基于成像的方法已开始探索对sgRNA文库进行空间分辨检测，这为未来整合sgRNA和转录组检测的空间分辨CRISPR筛选铺平了道路。基于测序的空间CRISPR筛选提供了一种高通量方法，将基因功能和调控通路与空间表型联系起来，填补了空间生物学中全转录组水平分析的空白。

结果1、用于空间CRISPR筛选和空间转录组学测序的SPAC-seq

核心原理与工作流程

文库构建与引入：将混合的sgRNA文库导入目标细胞，并利用GFP荧光标记进行分选。

体内模型：将扰动后的细胞注入小鼠模型（如肿瘤、T细胞浸润模型）。

空间捕获：收取目标组织切片，使用单细胞分辨率空间转录组平台（如Visium HD或Stereo-seq），在组织原位同时捕获mRNA和sgRNA。

测序定位：通过二代测序，将sgRNA和转录组数据映射回其原始空间坐标。

关键创新与优势

独特的质粒设计：该研究自研了 SPACseq 质粒。

高效转导：基于逆转录病毒，在小鼠原代细胞（如CD8+ T细胞、MC38细胞）中效率显著高于慢病毒载体。

高效表达：mRNA中嵌入的sgRNA表达量比主流方法（CROP-seq）高出9倍，与基因组DNA检测结果的相关性极高（ρ>0.94），显著降低了单细胞转录组数据中常见的“丢失”问题。

双捕获模式：兼容两种sgRNA捕获策略：

mRNA嵌入法：捕获mRNA转录本时连带获取嵌入其中的sgRNA。

探针直接捕获法：设计特异性探针直接在原位捕获sgRNA。

性能验证结果

通过一系列验证实验证明了该技术的可靠性：

精准性：与传统的基因组DNA测序结果高度一致（ρ高达0.997），并且能有效富集已知功能的基因（如MHC通路相关基因、B4galt1等）。

高通量：在一次肿瘤切片中成功回收了91.64% 的sgRNA（共1520种），展现了高捕获效率。

空间分辨率：

细胞仓水平：35%的空间仓被单一无歧义的sgRNA成功注释。

单细胞水平：利用图像分割算法，超过95% 的sgRNA计数能成功分配至单个细胞边界，约45%的细胞被单一无歧义的sgRNA注释。

空间一致性：大多数扰动（约86%的基因扰动）在不同组织切片中表现出高度保守的空间定位和功能表型，证实其在三维空间中的稳定性。

结果2、空间转移筛查揭示了TCR共刺激在肿瘤监测中的作用

研究发现，敲除肿瘤细胞的Icam1基因会显著促进肿瘤转移和免疫逃逸。

表型：相比于非靶向对照组，Icam1扰动的肿瘤细胞在肺转移中高度富集，并显著定位于免疫排斥生态位。

微环境特征：在Icam1扰动的肿瘤区域，呈现出 “T细胞贫乏、巨噬细胞丰富” 的免疫抑制表型。具体表现为：

T细胞排斥：细胞毒性CD8+ T细胞浸润显著减少。

巨噬细胞极化：M2样免疫抑制型巨噬细胞增多，炎症性巨噬细胞减少。

分子机制：

破坏关键互作：Icam1敲除导致肿瘤细胞与T细胞的关键配体-受体对（Icam1-Lfa-1）相互作用受损。

信号通路变化：与对照组相比，Icam1扰动区域中，细胞分裂和肿瘤生长相关通路上调，而干扰素（IFN）信号通路下调。

细胞因子改变：免疫刺激性细胞因子（如Il12a、Cxcl9、Cxcl10）表达降低；免疫抑制性因子（如Spp1、Cd163）表达升高。

技术应用：TARDIS分析工具

为了分析高维度的空间扰动数据，研究人员开发了TARDIS，该工具支持：

将sgRNA与空间转录组数据对齐。

对sgRNA文库进行预处理和统计建模。

分析扰动在空间上的全局和局部富集效应。

进行下游空间通路分析。

结果3、时空维度 T 细胞筛选揭示CD44调控 T 细胞定位的作用

为探究 T 细胞自身状态如何结合肿瘤微环境信号，影响 T 细胞在肿瘤内的空间分布与功能，本研究利用SPAC-seq技术筛选调控 CD8⁺T 细胞肿瘤浸润的功能基因，并采用两步 CRISPR 筛选策略精简文库：

第一步：无偏向性体内 bulk 浸润筛选

筛选功能缺失后可增强 T 细胞肿瘤浸润的基因。研究整合批量 RNA 测序与单细胞 RNA 测序数据，选定 2135 个目标基因、9040 条单引导 RNA（sgRNA）。将转染文库的 OT1-Cas9 T 细胞过继回输至荷瘤小鼠体内开展筛选，最终回收率达 99.62%，实验结果可靠。借助 MAGeCK 分析，筛选出多个在肿瘤浸润 T 细胞中富集的基因（含已知阳性对照基因），验证了筛选体系有效性。功能富集分析显示，候选基因主要参与细胞因子分泌负向调控、细胞分化、信号转导、细胞间通讯及应激应答等通路，证实环境感知对 CD8⁺T 细胞浸润与存活至关重要。

第二步：体内时空 CRISPR 筛选

选取第一步排名前 33 的基因构建小型文库，分别在荷瘤第 4、7、10 天收取肿瘤，捕捉 T 细胞浸润的不同阶段；结合 SPAC-seq 同步解析基因扰动信息与高分辨率转录组。

时序分析发现：CD8⁺T 细胞数量在第 4–7 天扩增、7–10 天回落，而肿瘤恶性细胞在第 7 天后快速增殖，提示肿瘤微环境从支持 T 细胞浸润转向免疫抑制；肿瘤巨噬细胞的数量变化趋势与 T 细胞相近，提示两类细胞存在相互作用与调控关系。

利用 CellCharter 划分出 12 个肿瘤空间区域，各区域随时间动态扩张、收缩；免疫活化相关区域在实验后期占比下降，进一步印证微环境免疫抑制性增强。T 细胞整体区域偏好性在病程中保持稳定。根据基因扰动在不同区域的富集特征，将 sgRNA 分为 3 类功能模块，证实 CD8⁺T 细胞的空间定位受基因功能调控，且和肿瘤微环境组成密切相关。

还归纳出 6 条代表肿瘤微环境核心特征的基因通路。随着肿瘤进展，干扰素应答、抗原呈递通路逐步减弱，而氧化应激、活性氧应答等肿瘤核心相关通路持续占主导，整体微环境逐步走向免疫抑制。

关联基因扰动模块与微环境通路后发现：CD44基因扰动归属于第一模块，其与干扰素应答、抗原呈递通路显著正相关，与活性氧、氧化应激通路负相关。这说明 CD44 缺失的 T 细胞会定向富集于干扰素信号活跃、氧化应激水平低的区域。

利用 TARDIS 算法评估基因对 T 细胞空间定位的影响，CD44是改变 T 细胞整体及局部区域偏好性最显著的基因；而已知调控 T 细胞内源通路的 Zc3h12a，对细胞空间定位几乎无影响。组织免疫荧光实验也在体内证实，CD44 敲除会明显改变 T 细胞的肿瘤分布位置。此外，CD44 敲除的 CD8⁺T 细胞可长期维持效应细胞表型。

综上，CD44 介导了 CD8⁺T 细胞在肿瘤微环境中的空间定位与细胞存续。

结果4、CD44 通过调控线粒体活性氧（ROS）抑制 CD8⁺T 细胞的抗肿瘤免疫

前期发现敲除 CD44 可促进 CD8⁺T 细胞向肿瘤及干扰素信号富集区域浸润，据此推测 CD44 会抑制 CD8⁺T 细胞功能，尤其是干扰素 -γ（IFN-γ）的分泌能力。

体外实验证实：抗原再刺激后，CD44 敲除（CD44 KO）小鼠 CD8⁺T 细胞的 IFN-γ、肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）表达量显著升高；人源 CD8⁺T 细胞实验也得到一致结果。CD44 缺失不影响 T 细胞增殖，但体外杀伤肿瘤细胞的能力明显增强；使用抗体阻断人 T 细胞表面 CD44，同样能提升其杀瘤效果。

转录组分析显示，CD44 KO T 细胞高表达记忆 T 细胞、干扰素通路相关基因，T 细胞耗竭标志物 Tim3 表达下调。同时细胞呈现干细胞样、组织驻留样特征，线粒体形态偏向记忆 T 细胞特有的融合状态。长效杀伤实验证明，CD44 缺失的 T 细胞可长期维持强效杀伤能力，不会快速衰退。

人源细胞检测进一步表明，敲除 CD44 会促使 T 细胞从耗竭倾向的中间态，转向效应记忆、中央记忆表型。

转录组数据提示 CD44 KO 细胞氧化应激水平降低。研究证实，CD44 可维持 T 细胞内线粒体 ROS 处于较高水平；敲除 CD44 后，小鼠及人源 CD8⁺T 细胞的线粒体 ROS 含量均显著下降。线粒体 ROS 高水平会伴随 T 细胞耗竭、IFN-γ 分泌减少；而 CD44 敲除可打破这一关联，依靠降低线粒体 ROS，提升细胞因子分泌能力，并助力 T 细胞在肿瘤内存活。

体内过继细胞回输（ACT）实验结果明确：

CD44 KO 的 CD8⁺T 细胞能更强地抑制肿瘤生长，肿瘤浸润数量更多、体内存活更久；

该类细胞耗竭程度更低，在竞争性浸润实验中相比对照组更具优势；

联合抗 PD-1 免疫检查点治疗时，普通 T 细胞疗效会快速衰减，CD44 敲除 T 细胞则能持续发挥抗肿瘤作用。

敲除 CD44 可下调线粒体 ROS，减轻 T 细胞耗竭、强化记忆 / 干细胞样表型，全面提升 CD8⁺T 细胞的肿瘤浸润、存活与长效杀瘤能力。

结果5、靶向 CD44 可解除 SPP1-CD44 通路对 CD8⁺T 细胞的抑制作用

研究借助 SPAC-seq 分析 CD44 敲除（CD44 KO）T 细胞与肿瘤微环境（TME）的互作，发现 CD44 敲除后，微环境中Spp1等免疫抑制相关基因表达显著下调。SPP1 主要由免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）分泌，是 CD44 的配体，二者形成SPP1-CD44 信号轴，可抑制 CD8⁺T 细胞分泌 IFN-γ。

空间测序、免疫荧光结果证实：SPP1⁺细胞与 CD44⁺ T 细胞在肿瘤组织中高度共定位，且紧邻 SPP1⁺巨噬细胞的 T 细胞更易呈现耗竭表型；小鼠及人结直肠癌样本均验证了这一空间分布特征。

CD44 敲除后，T 细胞与 SPP1⁺巨噬细胞的空间结合显著减少，二者相互作用被削弱。

体外共培养实验验证通路功能：

野生型 T 细胞接触 SPP1、SPP1 高表达巨噬细胞后，IFN-γ 分泌、肿瘤杀伤能力明显受抑；CD44 敲除 T 细胞则不受该抑制作用影响。

SPP1 通过 CD44 上调 T 细胞线粒体 ROS 与胞内铁离子水平，下调铁死亡相关保护蛋白 NRF2、GPX4，诱导 T 细胞铁死亡与功能障碍。

CD44 敲除可逆转上述变化：细胞铁离子、ROS 水平回落，铁死亡被抑制；同时细胞糖酵解能力增强、ATP 生成增加，代谢重编程为有氧糖酵解，效应功能得以维持。

体内实验进一步验证疗效：

单独使用抗 SPP1 抗体，可抑制肿瘤生长、降低 T 细胞耗竭与线粒体 ROS；该疗法的作用依赖 CD44，对 CD44 敲除 T 细胞无额外增益。

巨噬细胞特异性敲除 Spp1 后，仅能改善野生型 T 细胞的抗肿瘤效果，无法进一步提升 CD44 敲除 T 细胞功能。

清除巨噬细胞会削弱 CD44 敲除 T 细胞的治疗优势，证明巨噬细胞是 SPP1 的主要来源。

临床数据分析（人结直肠癌）显示：肿瘤高表达 SPP1，会伴随 ROS 升高、M2 型巨噬细胞增多、T 细胞浸润减少；免疫检查点抑制剂（ICB）治疗无效患者的 SPP1 表达更高；SPP1 与 CD44 共表达的患者预后更差。

综上，TME 中巨噬细胞分泌的 SPP1 通过结合 T 细胞表面 CD44，激活下游通路引发铁蓄积、ROS 升高、铁死亡及代谢紊乱，持续抑制 CD8⁺T 细胞功能；靶向阻断 CD44 或 SPP1，可解除该免疫抑制轴，显著提升 T 细胞抗肿瘤能力。

结果6、空间互斥基因筛选揭示调控 CD8⁺T 细胞趋化作用的转录机制

研究发现，肿瘤微环境信号会改变 CD8⁺T 细胞自身状态，进而调控其空间定位，二者可通过特异性表达的调控基因相互作用。本研究采用两步筛选策略开展探究：先进行生信筛选，再结合 SPAC-seq 空间测序验证。

第一步：单细胞水平生信筛选

分析超 32 万例人和小鼠肿瘤浸润 CD8⁺T 细胞数据，筛选出单细胞层面表达互斥的基因对。结果显示，排名靠前的基因对主要富集于趋化因子受体与转录因子，且人、小鼠数据结论高度一致，筛选结果可靠。

聚类得到 3 个保守的基因调控簇，分别对应不同 CD8⁺T 细胞功能状态；转录因子呈现细胞状态特异性表达，可调控细胞固有表型与基因互斥表达模式。

进一步利用泛癌空间转录组数据，对初筛得到的 477 个基因开展空间表达分析，鉴定出 104 对空间表达互斥基因、425 对空间共定位基因。空间互斥基因集中在趋化相关分子、转录因子及 T 细胞状态标志物上，证明转录因子与趋化因子受体可同时调控 CD8⁺T 细胞的内在表型与空间分布。

第二步：体内 Perturb-seq + SPAC-seq 功能验证

选取 32 个空间互斥的转录因子与趋化因子受体，构建 sgRNA 文库开展体内筛选。

转录组分析（Perturb-seq）：解析出 6 类基因表达程序，其中两类富集细胞因子 - 受体通路，介导细胞间通讯。依据转录变化将转录因子扰动分为 3 个功能模块，发现Bhlhe40 与 Cxcr4 存在负向调控关系：敲低 Bhlhe40 会使 Cxcr4 表达上调，反之亦然。

BHLHE40 原本促进 T 细胞向肿瘤内部浸润、参与 T 细胞耗竭；CXCR4 则介导 T 细胞沿配体 CXCL12 迁出肿瘤。因此敲除 Bhlhe40 会通过上调 CXCR4，促使 T 细胞迁出瘤体、削弱肿瘤浸润能力。

细胞分群结果显示，敲除 Bhlhe40 可提升效应 T 细胞、效应记忆 T 细胞比例，降低细胞耗竭水平。

空间测序（SPAC-seq）：划分出 5 类肿瘤空间区域，Cxcr3、Bhlhe40是影响 T 细胞空间定位最关键的分子。敲除 Bhlhe40 的 T 细胞更多聚集在肿瘤纤维化区域，而非肿瘤实质区，且该类细胞与 CXCL12-CXCR4 通路位点高度共定位，对趋化信号的感知能力显著增强。

荧光原位杂交（sgRNA-FISH）、组织染色证实：敲除 Bhlhe40 的 T 细胞大量富集在肿瘤纤维化边缘，与高表达 CXCL12 的细胞、血管内皮细胞相邻，提示 CXCL12-CXCR4 信号可介导 T 细胞经脉管迁出肿瘤。

体内过继回输模型验证：敲除 Bhlhe40 的 T 细胞控瘤能力下降，但细胞耗竭程度降低、在瘤周留存时间更长。

研究发现一条全新的转录因子 - 趋化因子受体调控轴：转录调控可重塑 CD8⁺T 细胞内在状态，并通过响应微环境趋化信号，最终决定细胞在肿瘤内的空间分布与功能。

最后来看看方法

生活很好，有你更好。