课前准备（Xenium）--空间结构是导致膀胱癌新辅助免疫治疗中批量生物标志物指导筛选失败的原因

作者，Evil Genius

我们的人生不可能每一步都走对，而每一步都走错的概率却非常高，所以我们更多只能往前看，不问过往，不惧将来。

从高中同学的工作分布来看，科研类的相关岗位，属于最苦，最不挣钱的，所以必须读博进编制来做；其他岗位，例如电气、通讯、自动化等这都属于好专业。

问大家一句，如果可以重来，大家当初还会选择现在的专业么？

空间转录组由于研究空间的细胞组织分布，所以在临床运用的重要性，也越来越明显。

今日参考文章

知识积累

治疗应答受bulk检测无法捕捉的空间结构所支配，包括：CD8⁺ T细胞与癌细胞的空间邻近性、上皮癌细胞富集区域内的局部检查点共表达，以及非应答者中成纤维细胞富集的免疫排斥区域。

膀胱癌流行病学与治疗现状

全球负担：每年新发膀胱癌病例超过57万，年死亡约20万例。

分型比例：75%为非肌层浸润性，25%为肌层浸润性膀胱癌（MIBC），属于侵袭性较强的类型。

标准治疗：根治性膀胱切除术仍是最常见手段；基于顺铂的新辅助化疗（NAC）可使5年总生存率绝对提高5%–8%，癌症相关死亡风险相对降低16%。

新进展：NIAGARA研究显示，在顺铂+吉西他滨基础上加用抗PD-L1免疫检查点抑制剂（ICI）度伐利尤单抗，术后继续使用1年，可进一步提高总生存期，该方案已被纳入国际指南。

ICI治疗与生物标志物研究背景

ICI双药疗效：小型单臂II期试验显示，ICI联合治疗的病理完全缓解（pCR）率约为37%–46%。

回顾性发现的生物标志物：多项回顾性分析（包括尿路上皮膀胱癌）发现，与T细胞浸润、高干扰素γ（IFN-γ）信号、低TGFβ信号相关的基因表达谱可预测ICI疗效。

TIS评分：基于18个IFN-γ相关基因的肿瘤炎症特征（TIS）评分被报道为最稳健的预测生物标志物之一，其区分能力在不同癌种中保持一致，且在泛癌层面与预后相关，被认为可间接反映“炎症型肿瘤”表型，有潜力指导跨癌种免疫治疗。

从回顾性到前瞻性的转化难题

转化研究瓶颈：包括TIS在内的多数回顾性发现的标志物，很少被前瞻性地验证其临床实用性以指导患者分层和治疗优化。

唯一先例：目前已知的唯一随机化研究是针对III期黑色素瘤的DOMINI试验，根据IFN-γ评分分配治疗，结果显示高评分组缓解率更高，但该试验未设标准治疗对照组。

基于空间转录组学的机制探索

研究契机：该临床试验的阴性结果为深入探究生物标志物失败原因提供了独特机会。

数据规模：研究团队构建了迄今最大的膀胱癌单细胞空间转录组数据集（覆盖约540万个细胞，分析377个基因）。

关键发现：治疗应答受特定空间结构限制，如成纤维细胞介导的免疫排斥和免疫细胞-肿瘤细胞间距离，这些因素在批量检测中完全不可见。

结果1、研究设计、患者特征和安全性

试验名称与性质：DUTRENEO试验是一项多中心、开放标签的II期研究，在西班牙11家三级医院开展。

入组条件：

经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT）确诊为肌层浸润性膀胱癌（MIBC，分期T2–T4a），不论是否有可见残留病灶；

适合接受顺铂治疗；

计划行膀胱切除术；

ECOG体能状态评分为0–1（即身体状况良好）；

有足够的基线肿瘤组织用于TIS评分检测。

患者筛选与分组

筛选情况：共筛查101例患者，其中28例筛选失败。

分层逻辑：

TIS高评分（“热”肿瘤） 患者→随机分配至ICI（免疫检查点抑制剂）组或标准顺铂-based新辅助化疗（NAC）组；

TIS低评分（“冷”肿瘤） 患者→直接分配接受标准NAC。

基线特征与安全性

基线特征：三个治疗组患者的临床和病理基线特征无显著差异。

安全性：不良事件和毒性与既往报道的NAC和ICI治疗基本一致，未出现新的安全性信号。

疗效结果（主要终点未达成）

主要终点未达到：热肿瘤中ICI组的pCR率（39%）并不显著优于NAC组（30%）（p = 0.51，OR = 1.64）。

降期率：热肿瘤组50%，冷肿瘤组60%，ICI治疗组62%。

反常趋势：冷肿瘤接受NAC的pCR率（55%）反而高于热肿瘤接受NAC（30%），但差异无统计学意义（p = 0.31）。这提示TIS评分未能富集ICI应答者，也未能识别与化疗敏感性相关的特定肿瘤生物学特征。

生存分析

无进展生存期（PFS）：三组间无显著差异（p = 0.7）。

总生存期（OS）：三组间无显著差异（p > 0.6）。

TIS评分与应答：各治疗组中，应答者与非应答者的TIS评分无显著差异，但ICI应答者中评分有偏高趋势（p = 0.097）。

外部比较：本试验的pCR率与其他在未筛选MIBC人群中评估ICI的研究结果相似，说明TIS分层未能有效富集应答人群。

回顾性阈值分析：若采用更高的TIS阈值，虽然能提高应答者比例，但会牺牲掉大部分对新辅助免疫治疗实际有应答的患者。

多组学特征分析（探究失败机制）

样本与方法：

WES（全外显子测序）：44例

bulk RNA-seq：66例

Xenium高分辨率空间转录组学：20例，覆盖5,399,355个单细胞，每样本约22.4万个细胞，检测377个基因

代表性验证：

驱动基因突变频率（TP53、FGFR3、PIK3CA、KMT2D）与大型公共队列一致；

分子亚型分布与既往报道一致（TURBT采样固有的管腔型偏倚），且亚型分布与治疗分组或应答无关。

热肿瘤 vs 冷肿瘤的分子差异：

热肿瘤富集：TP53、RB1、ARID1A突变；免疫相关基因（IDO1、IFNG）高表达；免疫通路富集（TCR信号、NK细胞介导细胞毒性）。

冷肿瘤富集：FGFR3、STAG2突变；FGFR3表达升高；管腔亚型为主。

空间转录组揭示的关键发现

细胞组成：热肿瘤中免疫细胞比例显著更高（B细胞、CD4 T细胞、Tregs、CD8 T细胞），且与TIS评分强相关。

空间距离：热肿瘤中上皮细胞与其最近免疫细胞之间的中位距离显著更短。

核心结论：TIS评分确实能区分“炎症型”与“非炎症型”肿瘤，也能反映免疫细胞丰度，但仅凭免疫通路活性不足以预测临床获益，空间组织结构才是决定应答的关键因素——这也解释了为何基于批量检测的TIS最终失败。

细胞组成和免疫-肿瘤空间距离是影响应答的核心因素，而这些都是批量检测无法捕获的。

结果2、免疫检查点基因表达和对ICI的反应

既往研究提示，免疫检查点基因表达可能作为预测免疫检查点抑制剂（ICI）疗效的生物标志物。

采用标准免疫组化（IHC） 检测的PDL1蛋白水平与临床特征或治疗应答均无关联。

bulk RNA-seq检测的转录水平

与无应答者相比，应答者的肿瘤组织中以下基因转录水平显著更高：

CD274（PDL1）：log₂差异倍数 >1.8，p = 0.001

CTLA4：log₂差异倍数 >2，p = 0.002

空间转录组（Xenium）解析细胞来源

PDL1的细胞来源呈双峰分布：

11例患者中：

4例（>50%的PDL1转录本来自癌细胞）→ “上皮主导型”

6例（<25%来自癌细胞）→ 非上皮主导型

这种双峰分布不仅取决于上皮细胞总数，也反映了细胞组成和细胞类型特异性转录调控的共同作用。

但PDL1的来源模式本身并不能独立分层预测治疗应答。

CTLA4的细胞来源：

主要来自Treg细胞（占13%–34%的转录本）；

但CD8⁺ T细胞内的CTLA4表达（占2%–30%）与ICI应答显著相关（p = 0.0043）。

多检查点基因在细胞类型中的表达差异

分析了PDL1、CTLA4、LAG3、TIM3及其结合配体（PD1、CD86）在所有细胞类型中的平均表达，并计算标准化均差（Cohen's d） 来量化应答者与非应答者的差异。

关键发现（应答者 vs 非应答者）：

PDL1蛋白IHC检测无效；批量RNA-seq显示应答者CD274和CTLA4更高；空间数据揭示，这源于CD4⁺ T、CD8⁺ T、浆细胞/NK细胞等多个细胞类型中PD1、CTLA4、TIM3、LAG3的协同上调，而非单一细胞来源。这表明空间分辨的细胞类型特异性检查点表达比整体水平更具生物学和临床意义。

结果3、细胞邻域与应答的空间结构

研究者发现，免疫细胞与肿瘤细胞的距离越近，ICI疗效越好；成纤维细胞增多可能构成物理屏障，阻碍免疫细胞接近肿瘤；整体免疫细胞数量并不能准确预测疗效，关键在于空间上的“近身”程度。后续以25 μm为尺度展开精细的邻域分析。

结果4、应答患者中空间受限的检查点信号

结果6、空间研究设计的通用框架

为将空间生物标志物推向临床，研究者通过系统下采样模拟，确定CD8⁺ T细胞-癌细胞最短距离是最佳预测指标，并建立定量标准：至少77个基因 + ≥3 mm直径组织区域才能稳定保留预测信号；而目前常用的1 mm TMA采样面积过小，统计效能不足，不适合验证空间结构类生物标志物。

最后，来看看方法

生活很好，有你更好。