课前准备--人类肠道相关淋巴组织图谱揭示B细胞的免疫调节相互作用

作者，Evil Genius

距离300万字出关的日子很近了。

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知识积累

微解剖分区：上皮下穹窿区（SED）是B细胞相互作用最活跃的区域。

关键细胞类型：DN2细胞在SED中富集，且其介导的相互作用以免疫抑制性为主（涉及CD86、progranulin、EBI3等分子），这解释了GALT为何能长期接触大量微生物抗原却不引发急性炎症。

临床相关性：溃疡性结肠炎（UC）患者阑尾GALT的微解剖结构被破坏，DN2细胞分布及免疫调节因子表达发生改变，提示GALT免疫调节功能的紊乱可能参与肠道炎症的发生。

核心观点：GALT通过B细胞产生的免疫调节因子维持一种“慢性活跃但非炎症”的稳态，该稳态一旦被打破，可能与炎症性肠病相关。

结果1、空间转录组学实现GALT中细胞谱系的可视化

技术路线：利用CosMx空间转录组平台获取阑尾组织数据，结合已发表的scRNA-seq参考数据集，通过数据转移方法将细胞谱系标签（如B细胞、T细胞、髓系细胞等）赋予空间转录组中的每个细胞，从而实现细胞类型的空间定位。

空间分布特征：

B细胞和T细胞倾向于聚集在同谱系区域（即“抱团”），邻域相似性最高。

髓系细胞则更倾向于分布在不同谱系混合的区域，邻域相似性最低。

统计学分析显示，所有细胞谱系都显著地与自己同谱系的细胞邻近。

细胞间相互作用：

间质细胞与髓系细胞、内皮细胞之间存在正向相互作用。

B细胞与所有其他谱系之间均为负向相互作用，说明B细胞在空间上相对“孤立”于其他类型细胞。

总体结论：该空间转录组方法成功揭示了GALT中不同免疫细胞谱系的有序空间组织结构，为后续研究B细胞与其他细胞的互作奠定了空间图谱基础。

结果2、数据整合实现在CosMx图像中识别B细胞亚群

技术挑战：CosMx平台的1000探针组所含基因不足以精细区分B细胞亚群，因此需要借助外部参考数据。

解决方案：研究团队自行生成了一个CITE-seq数据集（同时检测转录组和表面蛋白），从人阑尾分选B细胞进行测序，然后通过基于锚点的数据转移方法，将CITE-seq中精细的B细胞亚群标签（如过渡B细胞、活化初始B细胞、生发中心B细胞、DN2细胞、MZB细胞、类别转换记忆B细胞等）映射到CosMx空间数据中。

主要B细胞亚群鉴定依据：

过渡B细胞：CD10+

活化初始B细胞（aNAV）：CD11c+、FCRL5+

生发中心细胞：分为Ki67+的中心母细胞和Ki67−的中心细胞

DN2细胞：CD27−、IgD−、CXCR5−、CD21−、CD11c+（高表达FCRL4/5）

MZB细胞：CD27+、IgM+

类别转换记忆B细胞：CD27+、非IgM/IgD

关键空间邻近性发现：

浆母细胞与浆细胞在空间上邻近（发育相关）。

DN2细胞与髓系细胞在SED区域存在显著邻近性。

数据一致性验证：生发中心B细胞在空间数据中占比高于CITE-seq悬液数据，说明某些细胞类型在组织解离过程中可能损失，但空间数据能更真实反映其原位丰度。

跨平台数据整合策略有效克服了空间转录组探针数量有限的瓶颈，为后续研究B细胞亚群的空间互作提供了基础。

结果3、在CosMx数据集中鉴定GALT中B细胞的细胞间相互作用

分析方法：利用配体-受体数据库，结合空间邻近性（细胞间的“边”），识别B细胞与其他谱系细胞之间的潜在相互作用，并计算相互作用强度（结合配体表达量和受体表达量）。

空间分布特征：SED区域是全组织相互作用强度最高的区域，这与该区域细胞类型丰富、免疫活动活跃一致。

主要活跃亚群：aNAV细胞和DN2细胞虽然细胞数量不多，但与非B细胞谱系的相互作用强度最大，说明它们功能活跃。

DN2细胞的关键互作对象：DN2细胞与CD4 T细胞、CD8 T细胞、间质细胞和髓系细胞均有强相互作用，且DN2细胞既可作为信号来源（表达配体）也可作为靶细胞（表达受体）。

DN2细胞参与的功能通路：其相互作用广泛涉及细胞因子信号传导、白细胞活化、细胞运输和细胞迁移。

重要发现——非特异性相互作用：

IL-16被鉴定为DN2细胞与CD4+免疫细胞之间互作的介导分子。

但进一步验证发现，IL-16并非DN2细胞特有，而是由大多数B细胞普遍表达。

这种相互作用更多是由于空间上的邻近性（均在SED区域）所致，而非某个B细胞亚群的特异性功能。

结论：B细胞来源的IL-16与CD4分子的相互作用可能在组织中具有功能意义，但不属于任何特定B细胞亚群的专属特征。

结果4、B细胞亚群特异性标志物参与细胞间相互作用

不同亚群具有独特的相互作用谱：

初始B细胞：主要通过LTA-TNF受体通路参与淋巴组织稳态和炎症负调控。

MZB细胞：通过NOTCH2-DLL1与间质细胞互作，支持其在GALT中的发育。

DN2细胞是互作最活跃的亚群，其特异性相互作用包括：

TNFRSF13B-TNFSF13B：支持SED区域T细胞非依赖性IgA类别转换。

CD86、GRN、EBI3、SIGLEC10：编码免疫调节蛋白，主要定位于SED和生发中心区域。

DN2细胞在抗原呈递中的潜在作用：DN2细胞富集表达HLA、B2M、CD74等与抗原呈递相关的分子，与其表达CD86一致。

循环迁移差异：

MZB细胞、记忆B细胞和IgM-only B细胞表达CCR7，参与淋巴细胞再循环。

DN2细胞不表达CCR7，提示其较少参与系统性循环，可能更多驻留于组织局部。

通过亚群特异性标志物鉴定B细胞亚群，揭示了它们在GALT中通过配体-受体相互作用参与局部免疫功能调节的多样化和分工。

结果5、DN2细胞表达CD86、GRN和EBI3基因及蛋白

研究背景：前期分析发现DN2细胞表达的CD86、GRN和EBI3参与SED区域的细胞互作，本节以CD86为代表进行实验验证。

验证方法：

IMC（成像质谱细胞术）：使用mRNA靶向探针，在FFPE切片上同时检测多个标记物，识别微解剖结构。

IF（免疫荧光）和CM（共聚焦显微镜）：在蛋白水平验证CD86与B细胞标志物CD20的共定位。

DN2细胞鉴定：通过FcRL4⁺ CD11c⁺（ITGAX⁺） 双阳性来识别DN2细胞。

主要发现：

CD86 mRNA信号在DN2细胞中表达，包括位于上皮内的DN2细胞。

在SED区域，表达CTLA4的CD4 T细胞与CD86 mRNA信号紧密邻近，提示CD86-CTLA4可能介导DN2与CD4 T细胞之间的免疫调节相互作用。

蛋白水平验证：CD86与CD20（B细胞标志物）共表达于上皮内和SED区域，经共聚焦显微镜确认，排除了M细胞的干扰。

DN2细胞确实在基因和蛋白水平表达CD86，且其空间位置与表达CTLA4的CD4 T细胞邻近，支持DN2 B细胞通过CD86-CTLA4通路参与免疫调节的假说。

GRN（颗粒蛋白前体）验证

DN2细胞表达GRN mRNA：在SED区域确认DN2细胞（CD11c⁺ FcRL4⁺）表达GRN。

靶受体表达：GRN的受体TNFRSF1A和TNFRSF1B在SED区域表达，其中TNFRSF1B由CD68⁺髓系细胞、CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞表达，这些细胞恰好与表达GRN的DN2细胞位于同一区域。

蛋白水平验证：IF和CM确认B细胞在FAE和SED表达progranulin前体蛋白。

补充说明：大多数GRN并非由B细胞表达（提示还有其他细胞来源）。

EBI3验证

背景：EBI3是IL-27（+p28）和IL-35（+p35）的共同亚基。研究发现邻近细胞表达其受体IL27RA和IL6ST，提示EBI3可能介导细胞互作。

排除p28/p35：CITE-seq数据显示DN2细胞不显著表达IL27（p28）和IL12A（p35），说明DN2细胞产生的EBI3并非以完整IL-27或IL-35细胞因子形式发挥作用，可能以EBI3单体或其他形式参与调控。

表达验证：IMC确认DN2细胞表达EBI3基因，且在生发中心亮区也有表达；IF和CM在蛋白水平确认SED中B细胞表达EBI3。

结果6、GALT中的B细胞维持稳态，在UC中发生失调

健康对照 vs UC的空间结构差异

健康对照：B细胞和T细胞呈分区分布（各自聚集），组织结构有序。

UC患者：B细胞和T细胞混合分布，分区丧失，且不同UC样本之间异质性很大。

DN2细胞分布改变

健康对照：DN2细胞更靠近上皮（SED区域）。

UC患者：DN2细胞远离上皮，分布位置发生偏移。

免疫调节分子表达变化

健康状态下，DN2细胞通过表达CD86、GRN、EBI3等免疫调节分子，在SED区域维持免疫抑制性微环境，防止对肠道微生物的过度炎症反应。

UC状态下，B细胞分布异常 + 免疫调节分子表达谱改变（CD86下调、GRN/EBI3上调），导致局部免疫调节失衡，可能促进肠道炎症。

这为“GALT免疫调节功能紊乱参与炎症性肠病发病”提供了直接证据。

最后，来看看方法

生活很好，有你更好。