课前准备（xenium）--绘制人类小肠及类器官中的间质细胞多样性图谱

作者，Evil Genius

今日参考文献，看了这么多文献，基本上作者都有中国人的身影。

知识积累

小肠的精密结构（隐窝-绒毛轴、肌层与ENS协调）对功能至关重要。

虽已有大量单细胞研究探究肠道细胞异质性，但中胚层来源的成纤维细胞群体在人类发育和类器官中的定义仍不清晰。

scRNA + xenium数据分析。

主要发现：细胞亚群与空间定位

鉴定出平滑肌细胞（SMCs）和四个成纤维细胞亚群，分别占据特定解剖位置：

上皮下细胞（SECs）

固有层成纤维细胞（LPFs）

黏膜下层成纤维细胞（SMFs）

CXCL13⁺成纤维细胞

结果1、空间转录组学识别发育中人类肠道的主要细胞类别

基于已有scRNA-seq数据设计292基因Xenium空间转录组面板，检测7个发育中肠道FFPE样本（54–142 DPC），覆盖十二指肠、空肠、回肠和结肠，最终聚焦于小肠（475,698个细胞）。

技术方法：分两批次处理，第二批使用多模式细胞分割试剂盒改善细胞边界识别；两种分割方法对细胞类型分布无显著影响。

主要发现：

Xenium成功识别了scRNA-seq中所有主要细胞类别（上皮、间充质/成纤维细胞、内皮、免疫、ENS及平滑肌）。

Xenium与scRNA-seq的细胞比例存在差异，归因于技术差异（scRNA-seq组织解离易导致免疫细胞富集、上皮细胞比例偏低）。

成纤维细胞在两种平台中均约占细胞一半。

两个平台均在80–105 DPC检测到黏膜肌层，验证了已知发育时间节点。

核心优势：Xenium空间转录组学可直观呈现组织结构和细胞空间分布，弥补了scRNA-seq因组织解离而丢失的空间信息。

结果2、发育中肠道内多样化成纤维细胞群体的鉴定

数据预处理：从scRNA-seq中提取成纤维细胞群体，并排除SMCs、血管SMCs/周细胞、周期细胞和ICCs四个转录组差异过大的群体，以揭示非增殖性成纤维细胞的精细亚群。

四个成纤维细胞亚群的鉴定：

三个主要亚群（SECs、LPFs、SMFs）在所有发育阶段均存在；

第四个亚群CXCL13⁺成纤维细胞仅出现在最晚期样本（122–132 DPC），占比约5.5%；

Xenium同样识别出全部四个亚群，尽管未按年龄分离（因探针组较少）。

SECs的定位与特征：

SECs以高表达PDGFRA和F3为标记，在54–142 DPC所有阶段均存在；

空间定位上，SECs紧邻上皮，沿隐窝-绒毛轴呈单层分布；

F3在成纤维细胞中基本特异于SEC，但在早期上皮和晚期外肌层中也有低表达；

通过FISH独立验证（4个样本，57–125 DPC）确认SECs始终为紧贴上皮的单层细胞。

技术差异提示：scRNA-seq中SEC亚型比例随发育变化，而Xenium保持恒定，说明scRNA-seq的组织解离可能改变了亚型比例，空间转录组更能反映真实空间分布。

结果3、SMF（SHISA3⁺）群体与CXCL13⁺群体的定位

SMFs（SHISA3⁺）：

位于隐窝/黏膜肌层与外肌层之间的黏膜下层；

标记基因：SHISA3（最稳定可靠）、FIBIN、C1QTNF3；

发育早期为数层松散排列的细胞，105 DPC后随组织增厚扩展至整个黏膜下层空间；

FISH独立验证确认其黏膜下层定位。

CXCL13⁺成纤维细胞：

群体小而稀少，在scRNA-seq中于101 DPC后首次出现；

空间定位多样：隐窝附近SECs处、绒毛基底部、派尔斑内、绒毛中段（紧邻或整合于SEC层）；

FISH在125 DPC样本中验证其表达。

四个成纤维细胞亚群总览：

SECs：紧邻上皮，PDGFRΑ^高，F3⁺；

LPFs：绒毛核心，时间动态标记（早期FABP5⁺，后期ADAMDEC1⁺）；

SMFs：黏膜下层（外肌层与黏膜肌层之间），SHISA3⁺；

CXCL13⁺：稀有细胞，分布于绒毛基底部/隐窝上区、派尔斑，与SECs整合或相邻。

验证手段：FISH独立验证了SMFs和CXCL13⁺细胞的定位，与Xenium数据一致。

结果4、通过空间插补增强空间转录组数据的稳健性

Xenium基因面板的特征数量有限，虽然足以用于细胞分割、细胞类型识别和定位，但限制了细胞间通讯等下游分析。为克服这一局限，利用CytoSPACE将来自一个发育阶段（122–132 DPC）的scRNA-seq数据插补到分期相近的Xenium图谱（142 DPC）上。

应用验证：使用CellChat比较插补前后的细胞间信号预测：

插补显著增加了预测的信号相互作用数量；

三条经典通路（EGF、HH、WNT）的预测信号方向性与已知生物学一致：

EGF：ISCs（EREG）和肠上皮细胞（EGF）→ 靶细胞；

HH：ISCs和肠上皮细胞 → 靶细胞；

WNT：多种细胞（包括黏膜肌层SMCs）→ 上皮和ISCs。

核心优势：

有效克服Xenium探针组特征限制；

即使scRNA-seq和Xenium来自非匹配样本，方法依然稳健；

拓展了图谱及公共数据的分析潜力。

结果5、构建多能干细胞来源的HIOs空间图谱

研究目的：利用建立的人类肠道空间图谱，评估两种不同方法（EGF vs. EREG）分化的HIOs在移植后的细胞类型和组织结构。

技术处理：

使用人类特异性Xenium探针，小鼠宿主细胞转录本低，可通过特征计数过滤去除；

按特征计数过滤保留了侵入小鼠组织的人类细胞，同时去除tHIO内小鼠细胞。

细胞组成：

两种tHIOs均包含所有主要细胞类别（上皮、成纤维细胞、SMCs、ENS、内皮），唯独缺乏人类免疫细胞（已知两类方法均不含）；

两种tHIOs均有明显的外肌层和黏膜肌层；

EGF-tHIO中观察到稳健的内皮群体，虽出乎意料但可能与VEGF促进内皮存活及个体变异有关。

细胞比例比较（tHIO vs. 体内组织）：

上皮：~30% vs. ~33.7%（相近）；

成纤维细胞：22.4–25.2% vs. 32.8%（tHIO略低）；

SMCs：33.4–37.1% vs. 22.5%（tHIO较高）；

ENS：2.0–3.4% vs. 3.6%（相近）；

内皮：4.2–8.7% vs. 7.7%（相近）。

组织结构：

tHIOs自组织成多层结构，类似发育中小肠：单层上皮（隐窝-绒毛样轴）、固有层、黏膜肌层、含ENS和内皮的SMF层、两层外肌样层（也含ENS和内皮）。

关键结论：尽管移植前EGF和EREG HIOs细胞组成差异显著，移植后两者在细胞组成和组织结构上高度相似，均能重建类似发育中小肠的多层结构。

结果6、tHIOs中多样化成纤维细胞群体的鉴定

成纤维细胞亚群存在情况：

SECs、LPFs、SMFs在两种tHIO中均存在，CXCL13⁺成纤维细胞缺失（因其发育晚且依赖淋巴滤泡/免疫细胞）；

SEC比例：EGF 24.2% vs. EREG 24.1%（几乎相同）；

SMF比例：EGF 42.0% vs. EREG 47.8%（相近）；

LPF比例：EGF 18.8% vs. EREG 19.3%，但成熟状态不同——EGF-tHIO偏向未成熟（FABP5⁺/ADAMDEC1⁻），EREG-tHIO偏向成熟（FABP5⁻/ADAMDEC1⁺）；

两类tHIO均含有一群泛成纤维细胞阳性但缺乏亚型特异标记的未定类细胞。

空间组织：

SECs沿上皮排列，LPFs位于绒毛核心；

EGF-tHIO上皮表达F3（类似54 DPC未成熟组织），而EREG-tHIO不表达（类似>80 DPC成熟组织），提示EREG-tHIO上皮更成熟；

两种tHIO几乎每个类器官单位均有发育良好的黏膜肌层样层，早于体内（122 DPC）才形成的完整环状结构；

SMFs位于黏膜肌层与外肌层之间。

空间距离分析（层次聚类）：

EREG-tHIO在所有检测细胞类型中均与晚期胎儿样本（>105 DPC）聚类，提示空间组织成熟度一致；

EGF-tHIO表现不一致：ISC距离类似早期（54–57 DPC），SMF距离却类似成人组织，说明其空间组织不对应单一发育阶段。

核心结论：EREG-tHIO在细胞成熟状态和空间组织上均表现出更一致、更接近晚期胎儿的成熟特征；而EGF-tHIO存在异质性，不同细胞类型的空间成熟度不一致。空间距离分析可作为评估类器官组织成熟度的有效工具。

结果7、成人十二指肠空间图谱

研究对象：成人全层十二指肠样本（44岁，女性），使用相同Xenium探针组检测，验证胎儿期鉴定的成纤维细胞群体是否延续至成年。

主要发现：所有主要细胞类别和成纤维细胞亚型（SECs、LPFs、SMFs、CXCL13⁺）在成人中均存在，身份和空间定位得以维持，尽管部分基因表达存在差异。

细胞类型比例比较（成人 vs. 胎儿 vs. tHIOs）：

上皮：成人36.18% vs. 胎儿33.7% vs. tHIOs 30.1–33.8%（相近）；

成纤维细胞：成人17.22% vs. 胎儿32.8% vs. tHIOs 22.4–25.2%（成人较低）；

黏膜肌层：成人2.26%（远低于胎儿）；

ENS：成人1.65%（略低于胎儿/tHIOs）；

外肌层SMC：成人16.80%（相近）；

内皮：成人8.88%（相近）；

免疫细胞：成人17.01%（远高于胎儿）。

成纤维细胞亚型比例的关键变化：

SEC：胎儿16.4% vs. 成人17.79%（相近，稳定）；

CXCL13⁺：成人仅1.33%（仍属稀有）；

LPF：胎儿约25.2% → 成人64.67%（比例翻倍以上，成为主导亚型）；

SMF：胎儿44.8%（主导）→ 成人16.20%（大幅下降）。

空间组织变化：

胎儿期SMFs形成排列紧密的层状结构；

成人期SMFs变得松散，散布于黏膜下层细胞外基质和大血管之间，反映组织成熟和重塑。

成纤维细胞亚群身份从胎儿延续至成人，但亚型比例和空间分布随发育成熟发生显著重塑——LPFs在成人中占主导，SMFs则从紧密层状变为松散分布。

最后，来看看方法

Xenium数据细胞注释

xenium数据插补

空间通讯分析

空间距离分析

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