PNAS | AlphaFold3 的「记忆偏见」：它真的在预测配体诱导的构象变化，还是在回忆训练数据？

论文精读 | PNAS 2026, Vol. 123, No. 10 原文标题：Bias in the AlphaFold3 prediction of ligand-induced domain motion in enzymes 作者：Hao Yu, Ayse A. Bekar-Cesaretli, Maria Lazou, Dima Kozakov, Diane Joseph-McCarthy, Sandor Vajda 单位：Boston University; The University of Texas at Austin DOI：10.1073/pnas.2530709123 | 发表日期：2026年3月4日

一、为什么要读这篇论文？

自2021年 AlphaFold2 横空出世以来，深度学习驱动的蛋白质结构预测已经深刻改变了结构生物学的面貌。2024年，AlphaFold3（AF3）进一步将预测能力扩展到蛋白质-配体、蛋白质-核酸等多分子复合物的"共折叠"（cofolding）。一个自然的期望是：既然 AF3 可以同时接受蛋白质序列和配体 SMILES 作为输入，它应该能够建模配体诱导的蛋白质构象变化——这对药物设计和酶催化机制的理解十分重要。

然而，这篇发表于 PNAS 的论文通过系统性的大规模实验，揭示了一个令人不安的事实：AF3 对蛋白质构象的预测，在很大程度上是由训练数据中已有结构的数量比例决定的，而非由配体在计算中的实际存在与否驱动。 这种"记忆化"（memorization）效应不仅存在于 AF3 中，在 AF2 中同样显著。更令人担忧的是，已知不会结合的配体也能诱导类似的构象变化，而 pLDDT 置信度分数不足以可靠地区分真正的结合物与非结合物。

这些发现对于所有使用 AlphaFold 系列工具进行蛋白质构象预测、虚拟筛选和药物设计的研究者来说，都具有重要的参考价值。

二、研究背景

2.1 酶的配体诱导结构域运动

许多酶在行使催化功能时，并非保持静态结构，而是经历显著的构象变化。典型的模式是：酶首先以开放构象（apo/open state）结合底物，随后结构域运动使酶转变为闭合构象（holo/closed state），将底物包裹在高度特异性的催化环境中。这种配体诱导的结构域运动在激酶、异构酶、转移酶等多种酶家族中普遍存在，其幅度可达 10–15 Å RMSD，远超一般的蛋白质主链柔性波动。

DynDom 数据库系统收录了此类酶的信息，每种酶由一对 apo 和 holo X 射线晶体结构代表，并标注了触发结构域运动的"trigger ligand"（触发配体）、固定结构域和运动结构域的残基范围。

2.2 AF3 的共折叠能力与局限

AF3 的一大进步在于能够处理多分子输入，包括蛋白质序列和配体 SMILES 字符串。理论上，通过分别运行"仅蛋白质序列"和"蛋白质序列 + 配体 SMILES"两组计算，可以比较 AF3 预测的 apo 和 holo 构象，评估其建模配体诱导构象变化的能力。

已有研究表明，AF3 在预测相对静态的蛋白质-配体复合物结构方面优于传统对接方法，但对于涉及显著主链重排（>2–5 Å RMSD）的情况仍然是重大挑战。本文所研究的构象变化幅度更大（10–15 Å RMSD），理应更加困难。不过，一个缓解条件是：DynDom 数据库中的大多数结构都在 AF3 的训练集中——而这恰恰成为了问题的根源。

2.3 记忆化问题的已有线索

在本文之前，已有多项研究指出 AF2 和其他 ML 方法存在记忆化问题：

• • Chakravarty 等（2024）发现 AF2 对折叠开关蛋白的预测受结构记忆驱动
• • Lazou 等（2024）发现 AF2 在预测配体结合位点的多构象时可能"记住太多"
• • Bryant & Noe（2024）和 Schafer & Porter（2025）表明，从训练集中移除结构会改变 AF2 的预测结果
• • Škrinjar 等（2025）和 Masters 等（2025）对蛋白质-配体共折叠方法的记忆化进行了评估

本文在此基础上，首次系统、定量地揭示了 AF3 在酶配体诱导结构域运动建模中的记忆偏见。

三、实验设计

3.1 蛋白质数据集

从 DynDom 数据库中选取 82种具有配体诱导结构域运动的酶，每种酶拥有明确的 apo 和 holo 参考结构，以及已知的触发配体。

3.2 模型生成

对每种酶，使用 MMseqs2（Release 18）生成多序列比对（MSA）。AF3 使用默认参数，不使用模板结构：

• • 无配体组：输入 = 蛋白质序列 + MSA → 100个随机种子 × 5个预测 = 500个模型
• • 有配体组：输入 = 蛋白质序列 + MSA + 配体 SMILES → 100个随机种子 × 5个预测 = 500个模型

3.3 评估方法

所有模型和 PDB 结构在二维坐标系中展示：X 轴为与 apo 参考结构的 RMSD，Y 轴为与 holo 参考结构的 RMSD（对齐固定结构域后计算运动结构域的 RMSD）。每个模型被分类为"更接近 apo"或"更接近 holo"。同时评估配体放置精度（配体 RMSD）和预测置信度（pLDDT）。

3.4 关键分组策略

根据 PDB 中每种酶 apo 与 holo 结构的数量比，将82种酶分为三组：

这一分组是理解全文结果的核心框架。

四、核心发现

4.1 发现一：预测构象由训练数据比例主导，而非配体存在

这是本文最核心的结论。

Group 1（apo 占优的酶）：无配体时，64.8% 的模型更接近 apo 参考结构。加入配体后，接近 apo 的比例仅降至 52.9%，即配体只让 11.9% 的模型从 apo 侧转向 holo 侧。

Group 2（holo 占优的酶）：无配体时，75.5% 的模型已经更接近 holo 参考结构——尽管计算中根本没有提供任何配体。加入配体后，比例上升至 84.6%，增幅仅 9.1%。

关键对比：

训练数据组成带来的效应（40.3%）是配体实际作用（9–12%）的 3.5–4.5 倍。 这是非常强烈的记忆化证据。

Group 3（数据稀少的酶）：配体的影响相对更大，将 holo 模型比例从 58.5% 提升至 76.0%（增加 17.5%）。这说明在记忆偏差较弱的情况下，AF3 确实能更多地依赖配体信息进行预测。

4.2 发现二：配体放置精度与训练数据丰富程度正相关

AF3 在不同组中放置配体的精度差异显著：

这一结果看似矛盾——Group 2 的配体放置更准确，但这并非 AF3 "理解"了配体结合的物理化学原理，而是因为训练数据中大量 holo 结构使得结合位点默认处于闭合态，配体恰好被放入了一个预先形成好的口袋中。

对于 Group 1 的酶，即使加入配体，仍有 52.9% 的模型停留在开放态，结合位点尚未形成，自然无法准确放置配体。

4.3 发现三：非结合配体也能诱导类似的构象变化

研究者针对 Table 1 中的 12 种酶，分别选取了文献中已知不会结合的小分子，重复了 AF3 共折叠计算。结果令人惊讶：

• • Group 2（holo 占优）：非结合配体同样诱导了接近 holo 的构象，虽然部分蛋白的闭合程度略有下降。非结合配体的 pLDDT 值显著低于天然配体，但构象分布本身非常相似。
• • Group 1（apo 占优）：非结合配体产生的 holo 模型比天然配体更少，对部分酶（如 enolase 1）差异较大。但 pLDDT 分布的变化很小，意味着非结合配体几乎以与天然配体相同的置信度被放置。
• • 特别案例——长链脂肪酸 CoA 连接酶：非结合物油酸的分子量远大于天然触发配体 ANP，但 AF3 仍然生成了非常相似的 holo 模型。这一案例有力地说明，配体的放置主要由结构记忆而非相互作用物理驱动。

关于 pLDDT 区分能力的结论：虽然非结合配体的 pLDDT 值总体略低于天然配体，但这种差异通常不足以可靠地区分结合物与非结合物，特别是对于 Group 1 的蛋白。这对将 AF3 的 pLDDT 作为虚拟筛选打分标准的做法提出了警告。

4.4 发现四：AF2 表现出相同甚至更强的记忆化

AF2 无法显式处理配体，但研究者仍然用相同的协议生成了 500 个 AF2 模型进行比较：

• • Group 1：AF2 模型聚集于 apo 侧，与 AF3 无配体结果相似，但更多地向 holo 方向延伸。
• • Group 2：AF2 模型几乎全部聚集在 holo 参考结构附近，表现出比 AF3 更强的偏向。
• • Group 3：AF2 与 AF3 结果高度一致。

结论：AF2 和 AF3 同样受到记忆化的影响，这不是某个特定模型版本的问题，而是基于 PDB 训练的深度学习结构预测方法的系统性特征。

五、代表性案例详解

论文在 Table 1 中列出了 12 种酶的详细分析，以下摘取几个最具说明性的案例：

5.1 己糖激酶-4（Hexokinase-4, Group 2, apo:holo = 1:28）

己糖激酶-4 催化 ATP 的磷酸基团转移至葡萄糖。在缺少葡萄糖时，该酶主要存在于超开放构象。然而，由于 PDB 中有 28 个 holo 结构但仅 1 个 apo 结构，AF3 在完全没有葡萄糖输入的情况下，全部 500 个模型都更接近闭合态。加入葡萄糖后，模型进一步移向更闭合的 holo 亚群。配体 RMSD 平均低于 1 Å——但这完全归功于结合位点已"默认"闭合，而非 AF3 真正理解了葡萄糖的结合。

5.2 丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, Group 1, apo:holo = 8:4）

丙酮酸激酶催化丙酮酸被 ATP 磷酸化。500 个无配体模型聚集在两组 apo X 射线结构之间。加入 ATP 后，仅 63 个模型移向 holo 侧，大部分维持原位。少量 holo 模型甚至出现部分解折叠，远离 apo 和 holo 构象，置信度低。这表明对 apo 数据占优的蛋白，配体的影响有限。

5.3 磷酸丙糖异构酶（TIM, Group 2, apo:holo = 5:13）

TIM 在 apo 态有 5 种不同构象（活性位点附近两个环的构象多样性），但与 13 个闭合 holo 结构明确可区分。AF3 在无配体的情况下，全部 500 个模型聚集在闭合 holo 结构附近。加入触发配体 PGA 后，模型更加靠近 holo，配体 RMSD < 1 Å。这是记忆化效应的经典演示。

5.4 赖氨酸敏感天冬氨酸激酶3（Lysine-sensitive aspartokinase 3, Group 3, apo:holo = 1:1）

这是一个有趣的"错误标注"案例。DynDom 数据库将 ADP 错误标记为触发配体，但实际的构象变化由别构抑制剂赖氨酸（LYS）引起。基于错误信息，AF3 在无配体和有 ADP 时都产生了介于开放和闭合态之间的宽泛分布，配体置信度低。这说明在训练数据稀少且配体不正确时，AF3 缺乏将构象推向明确状态的能力。

六、讨论与启示

6.1 "程序在建模什么？"

论文引用了 Agarwal & McShan（2024）的警示：当机器学习方法远离生物物理学时，我们可能不太清楚程序实际在建模什么。AF2 的作者早已指出，由于网络同时在 apo 和 holo 结构上训练，模型可能与配体存在时的结构一致，即使 AF2 的输入中没有配体。更一般地说，模型倾向于产生训练数据中占主导的构象，但从 pLDDT 或 PAE 图中很难判断模型究竟更像 apo 还是 holo 形式。

AF3 的共折叠能力理论上可以消除这种不确定性——你可以显式地分别建模 apo 和 holo。然而本文的结果表明，这种"显式建模"的效力远弱于训练数据分布本身的驱动力。

6.2 对药物设计和虚拟筛选的影响

本文的发现对将 AF3 应用于药物设计具有直接影响：

1. 1. 对接精度的"虚假繁荣"：对于 PDB 中 holo 结构丰富的蛋白（Group 2），AF3 确实能以 <2 Å 精度放置配体，但这更多反映了训练数据的记忆而非对相互作用的理解。对于 holo 结构较少的蛋白（Group 1），对接精度大幅下降。
2. 2. 虚拟筛选的假阳性风险：非结合配体也能诱导类似构象变化，且 pLDDT 差异不足以可靠区分，意味着直接用 AF3 进行虚拟筛选可能产生大量假阳性。
3. 3. 构象选择性的不可靠性：无法确信 AF3 预测的"闭合态"真正反映了配体结合效应，还是仅仅是训练数据偏差的产物。

6.3 训练数据量少时配体影响更大

一个积极的发现是：Group 3 蛋白（训练数据稀少）的配体效应最为显著（+17.5%），说明当记忆偏差较弱时，AF3 确实能在一定程度上利用配体信息。这暗示，对于 PDB 中结构稀少的新靶点，AF3 的共折叠预测可能比对"常见"蛋白更有参考价值——但同时也伴随更高的不确定性（如 aspartokinase 3 案例所示）。

6.4 对 AI for Science 的广泛启示

本文的意义超越了蛋白质结构预测本身。它提示我们：

• • 数据驱动方法的偏差可能被隐藏：当训练集中某类样本占优时，模型输出可能反映数据分布而非物理规律，且这种偏差在单一案例中难以察觉，需要系统性评估才能暴露。
• • "正确"的结果未必基于"正确"的原因：AF3 对 Group 2 蛋白的配体放置精度很高，但原因并非它理解了结合，而是训练集的偏差恰好有利于此。
• • 显式输入不等于显式建模：仅仅将配体作为输入提供给 AF3，并不意味着模型会物理地"考虑"配体的作用。网络的隐式偏好可能压过显式输入的影响。

七、总结

一句话总结：AF3 在预测酶的配体诱导构象变化时，更多地是在"回忆"训练数据中占主导的结构类型，而非真正在"预测"配体的作用——这种记忆偏见在 AF2 中同样存在，对药物设计和构象预测的可靠性提出了重要警告。